Sfruttando Live Imaging ai Nuclei di pista durante il differenziamento dei mioblasti e Fusion
Summary
Differenziazione del muscolo scheletrico è un processo altamente dinamico, che in particolare si basa sul posizionamento nucleare. Qui, descriviamo un metodo per tracciare i movimenti di nuclei da formazione immagine di tensione delle cellule durante la formazione di differenziazione e miotubi dei mioblasti ed effettuare una caratterizzazione quantitativa delle dinamiche di nuclei di estrazione di informazioni da inseguimento automatico.
Abstract
Nucleare di posizionamento all’interno delle cellule è importante per molteplici processi cellulari, nello sviluppo e rigenerazione. L’esempio più intrigante di posizionamento nucleare si verifica durante la differenziazione del muscolo scheletrico. Fibre muscolari (myofibers) sono cellule multinucleated formate dalla fusione delle cellule del precursore di muscolo (mioblasti) derivati da cellule staminali del muscolo (cellule satelliti) che subiscono la proliferazione e la differenziazione. Corretto posizionamento nucleare all’interno di miofibre è richiesto per la rigenerazione muscolare adeguata e la funzione. La procedura comune per valutare la formazione di differenziazione e myofiber dei mioblasti si basa su celle fisse analizzate mediante immunofluorescenza, che ostacola lo studio del comportamento delle cellule e del movimento nucleare nel corso del tempo. Qui, descriviamo un metodo per l’analisi della formazione di differenziazione e myofiber dei mioblasti da formazione immagine di cellule vive. Mettiamo a disposizione un software per il rilevamento automatizzato ottenere una caratterizzazione quantitativa ad alta produttività delle dinamiche nucleare e comportamento dei mioblasti (vale a dire, la traiettoria) durante la differenziazione e la fusione nucleare.
Introduction
Il muscolo scheletrico è il tessuto più grande del corpo umano, per un totale di 35% – 40% della massa del corpo1. Le cellule satelliti sono cellule staminali del muscolo, anatomicamente caratterizzate dalla loro posizione (giustapposti alla membrana del plasma, sotto la lamina basale delle fibre muscolari), che danno origine ai mioblasti proliferanti (cellule progenitrici miogenico), che alla fine differenziare e integrare nelle miofibre esistenti e/o fusibile per formare nuove miofibre2,3,4. La loro scoperta e i progressi nello studio della loro biologia ha portato a significativi approfondimenti lo sviluppo muscolare e la rigenerazione.
Protocolli per isolare e differenziare i mioblasti in miotubi sono stati sviluppati molti anni fa e sono ancora ampiamente utilizzati per lo studio del muscolo scheletrico differenziazione5,6,7. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi rappresentano procedure statiche che si basano sull’analisi delle celle fisse e, di conseguenza, non consentono agli scienziati di esplorare pienamente processi altamente dinamici, come fusione dei mioblasti e maturazione miofibre. L’esempio più eclatante è il posizionamento del nucleare, che è strettamente regolata, con nuclei inizialmente nel centro della myofiber e, quindi, situata alla periferia dopo miofibre maturazione8,9. La formazione immagine dal vivo è la tecnica più appropriata per ottenere ulteriori approfondimenti tale fenomeno peculiare.
Qui, descriviamo un metodo che consente agli scienziati di registrare dei mioblasti differenziazione e miotubi formazione da microscopia time-lapse e per eseguire analisi quantitative dall’inseguimento automatico dei nuclei dei mioblasti. Questo metodo fornisce una caratterizzazione quantitativa ad alta produttività delle nucleare dinamiche e dei mioblasti comportamento durante la differenziazione e la fusione. Il protocollo è diviso in quattro parti, vale a dire (1) l’insieme di muscoli dalle zampe posteriori di topi, (2) l’isolamento di mioblasti primari che consiste nella digestione meccanica ed enzimatica, (3) dei mioblasti proliferazione e differenziazione e (4) live imaging per tenere traccia di nuclei all’interno le prime 16 ore di differenziamento dei mioblasti.
Nella procedura seguente, mioblasti sono isolate da topi H2B-GFP e trattati con 1 µ g/mL di doxiciclina per indurre l’espressione di H2B-GFP, come descritto in precedenza10. In alternativa, è possibile isolare i mioblasti da altri topi transgenici che esprimono una proteina fluorescente nel nucleo o a transfect le cellule isolate da topi wild-type per esprimere una proteina fluorescente nel nucleo, come descritto da Pimentel et al. 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fibre muscolari (myofibers) sono multinucleate che si formano dalla fusione di cellule precursori muscolari (mioblasti) derivata da cellule staminali del muscolo (cellule satelliti) che subiscono la proliferazione e la differenziazione2,3, 4. Per valutare stimola il differenziamento, la procedura comune consiste di coltura mioblasti in differenziando le medie e fissare le cellule in diversi momenti per eseguire immunofluorescen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da AFM-Telethon a E.V. (#21545) e con la concessione di seme di Ospedale San Raffaele (OSR) a S.Z. (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez dall’Hub di analisi di immagine dell’Institut Pasteur è riconosciuto per condividere pubblicamente la sua routine MATLAB “Semplice Tracker”.
Materials
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
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