Exploitatie van de levende Imaging te Track kernen tijdens Myoblast differentiatie en Fusion
Summary
Skeletspieren differentiatie is een uiterst dynamisch proces, die met name gebaseerd op nucleaire positionering is. Hier beschrijven we een methode voor het bijhouden van de bewegingen van de kernen door levende cel imaging tijdens myoblast differentiatie en myotube vorming en voor het uitvoeren van een kwantitatieve karakterisering van de dynamiek van de kernen door het extraheren van informatie van automatisch bijhouden.
Abstract
Nucleaire positionering binnen cellen is belangrijk voor meerdere cellulaire processen in ontwikkeling en regeneratie. Het meest intrigerende voorbeeld van nucleaire positionering optreedt tijdens de differentiatie van de skeletspieren. Spiervezels (myofibers) zijn multinucleaire cellen gevormd door de fusie van spier voorlopercellen (myoblasts) afgeleid van stam spiercellen (satelliet-cellen) die proliferatie en differentiatie ondergaan. Juiste nucleaire positionering binnen myofibers is vereist voor de juiste spier regeneratie en functie. De uniforme procedure te beoordelen myoblast differentiatie en myofiber vorming is afhankelijk van vaste cellen geanalyseerd door immunofluorescentie, die de studie van nucleaire verkeer en cel gedrag na verloop van tijd belemmert. Hier beschrijven we een methode voor de analyse van myoblast differentiatie en myofiber formatie door levende cel imaging. We bieden een software voor geautomatiseerde nucleaire tracking te verkrijgen van een kwantitatieve karakterisering van hoge-doorvoer van nucleaire dynamiek en myoblast gedrag (dat wil zeggen, het traject) tijdens de differentiatie en fusion.
Introduction
Skeletspieren is het grootste weefsel in het menselijk lichaam, totaal 35% – 40% van het lichaam massa1. Satelliet cellen zijn de cellen van de stam van het spier, anatomisch gekenmerkt door hun positie (naast aan het plasma-membraan, onder de basale lamina van spiervezels), die aanleiding geven tot delende myoblasts (myogenic voorlopercellen), die uiteindelijk differentiëren en integreren in bestaande myofibers en/of zekering formulier nieuwe myofibers2,3,4. Hun ontdekking en de vooruitgang in de studie van hun biologie heeft geleid tot belangrijke inzichten in spierontwikkeling en regeneratie.
Protocollen te isoleren en te onderscheiden van myoblasts in myotubes vele jaren geleden ontwikkeld en zijn nog steeds gebruikte om te studeren van skeletspieren differentiatie5,6,7. Meeste van deze methoden betekenen echter statische procedures die afhankelijk zijn van de analyse van vaste cellen en, bijgevolg, laat niet wetenschappers hoogdynamische processen, zoals myoblast fusion en rijping van de myofiber volledig te verkennen. Het meest opvallende voorbeeld is nucleaire positionering, die is strak geregeld, met kernen in eerste instantie in het midden van de myofiber en, vervolgens, gelegen aan de rand na8,9van de rijping van de myofiber. Levende imaging is de meest geschikte techniek om nadere te verkrijgen inzichten in dergelijk merkwaardige fenomeen.
Hier beschrijven we een methode waarmee wetenschappers met het opnemen van myoblast differentiatie en myotube vorming door time-lapse microscopie en kwantitatieve analyses uitvoeren van de automatisch bijhouden van myoblast kernen. Deze methode biedt een high-throughput kwantitatieve karakterisering van nucleaire dynamiek en myoblast gedrag tijdens de differentiatie en fusion. Het protocol is onderverdeeld in vier verschillende delen, namelijk (1) het innen van de spieren van de hindlimbs van muizen, (2) het isolement van de primaire myoblasts, die in de mechanische en enzymatische spijsvertering, (3) myoblast proliferatie en differentiatie, en (4 bestaat) Live imaging voor het bijhouden van de kernen binnen de eerste 16 h myoblast differentiatie.
In de volgende procedure, zijn myoblasts van muizen H2B-GFP werd geïsoleerd en behandeld met 1 µg/mL doxycycline ertoe H2B-GFP expressie, als eerder beschreven10. Als alternatief, is het mogelijk om te isoleren van de myoblasts van andere transgene muizen die uitdrukking geven aan een fluorescente proteïne in de celkern of naar de cellen die geïsoleerd van wild-type muizen uitspreken een fluorescente proteïne in de celkern, zoals beschreven door Pimentel et al. transfect. 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Spiervezels (myofibers) zijn multinucleaire cellen die worden gevormd door de fusie van precursoren spiercellen (myoblasts) afgeleid van stam spiercellen (satelliet-cellen) die ondergaan van de proliferatie en differentiatie2,3, 4. Om te beoordelen myoblast differentiatie, bestaat de uniforme procedure voor het kweken van myoblasts in de differentiatie van de middelgrote en tot vaststelling van de cellen op verschillende tijdst…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de AFM-Telethon e.v. (#21545) en door de toekenning van het Ospedale San Raffaele (OSR) zaad aan S.Z. (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez vanaf de Hub van de beeld-analyse van het Institut Pasteur is erkend voor het publiekelijk delen van zijn “Eenvoudige Tracker” MATLAB routines.
Materials
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
- Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans. Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).
- Roman, W., Gomes, E. R. Nuclear positioning in skeletal muscle. Seminars in Cell & Developmental Biology. , (2017).
- Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
- Foudi, A., et al. Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).
- Tirone, M., et al. High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).
- Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression. eLife. 5, e09100 (2016).
- Adamski, D., et al. Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation. FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
- . Simpel Tracker – File Exchange – MATLAB Central Available from: https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker (2016)
- Burkard, R., Dell’Amico, M., Martello, S. . Assignment Problems, Revised Reprint. , (2009).
- Falcone, S., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
