Explotando en la proyección de imagen a los núcleos de la pista durante la fusión y diferenciación de mioblastos
Summary
Diferenciación del músculo esquelético es un proceso altamente dinámico, que particularmente se basa en posición nuclear. Aquí, describimos un método para seguir los movimientos de los núcleos de proyección de imagen de vivo de la célula durante la diferenciación y myotube formación de mioblastos y se realiza una caracterización cuantitativa de la dinámica de los núcleos de extracción de información de seguimiento automático.
Abstract
Posicionamiento nuclear dentro de las células es importante para múltiples procesos celulares en el desarrollo y regeneración. El ejemplo más fascinante del posicionamiento nuclear ocurre durante la diferenciación del músculo esquelético. Las fibras musculares (myofibers) está formadas por la fusión de células precursoras de músculo (mioblastos) derivadas de células madre de músculo (células satélite) que experimentan la proliferación y diferenciación de células multinucleadas. Correcta posición nuclear en myofibers es necesaria para la regeneración muscular adecuada y la función. El procedimiento común para evaluar la formación de la diferenciación y del myofiber mioblastos se basa en las células fijas analizadas por inmunofluorescencia, que impide el estudio del comportamiento de movimiento y de la célula nuclear con el tiempo. Aquí, describimos un método para el análisis de diferenciación y myofiber formación de mioblastos por proyección de imagen de células vivas. Ofrecemos un software para el seguimiento automatizado nuclear obtener una caracterización cuantitativa de alto rendimiento de nuclear dinámica y comportamiento de mioblastos (es decir, la trayectoria) durante la diferenciación y la fusión.
Introduction
Músculo esquelético es el tejido más grande del cuerpo humano, por un total de 35% – 40% de la masa del cuerpo1. Las células satélite son células madre de músculo, caracterizadas anatómicamente por su posición (yuxtapuesto a la membrana plasmática, por debajo de la lámina basal de las fibras musculares), que dan lugar a la proliferación de mioblastos (células progenitoras miogénica), que eventualmente diferenciar e integrar en myofibers existentes o fusible forma nuevo myofibers2,3,4. Su descubrimiento y los avances en el estudio de su biología ha llevado a importantes conocimientos en desarrollo muscular y la regeneración.
Protocolos para aislar y diferenciar mioblastos a miotubos han sido desarrollados hace muchos años y siguen siendo ampliamente utilizados para el estudio de diferenciación de músculo esquelético5,6,7. Sin embargo, la mayoría de estos métodos representan procedimientos estáticos que se basan en el análisis de las células fijas y, en consecuencia, no permiten a los científicos explorar procesos altamente dinámicos, como la fusión de mioblastos y maduración del myofiber. El ejemplo más llamativo es nuclear, que es estrictamente regulado, con los núcleos inicialmente en el centro de la myofiber y, luego, situado en la periferia después myofiber maduración8,9. En proyección de imagen es la técnica más adecuada para obtener mayor información sobre un fenómeno tan peculiar.
Aquí, describimos un método que permite a los científicos realizar diferenciación y myotube formación de mioblastos por microscopia Time-lapse y realizar análisis cuantitativos de seguimiento automático de núcleos mioblastos. Este método proporciona una caracterización cuantitativa de alto rendimiento de comportamiento dinámica y mioblastos nuclear durante la diferenciación y la fusión. El protocolo se divide en cuatro partes diferentes, a saber: (1) la colección de músculos de los miembros posteriores de los ratones, (2) el aislamiento de mioblastos primario que consiste en la digestión mecánica y enzimática, la proliferación de mioblastos (3) y la diferenciación y (4) en vivo imagen de seguimiento de núcleos dentro de las 16 h de la diferenciación de mioblastos.
En el procedimiento siguiente, mioblastos aislados de ratones H2B-GFP y tratados con 1 μg/mL de doxiciclina para inducir la expresión de GFP H2B, como se describió anteriormente10. Alternativamente, es posible aislar los mioblastos de otros ratones transgénicos que expresan una proteína fluorescente en el núcleo o transfectar las células aisladas de ratones de tipo salvaje para expresar una proteína fluorescente en el núcleo, como se describe por Pimentel et al. 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las fibras musculares (myofibers) son células multinucleadas que se forman por la fusión de las células musculares precursores (mioblastos) derivada de células madre de músculo (células satélite) que experimentan la proliferación y diferenciación2,3, 4. Para evaluar la diferenciación de mioblastos, el procedimiento común consiste en el cultivo de mioblastos en diferenciar el medio y la fijación de las células en di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el AFM Telethon e.v. (#21545) y por el Ospedale San Raffaele (OSR) semilla a S.Z. (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez desde el centro de análisis de imagen del Instituto Pasteur es reconocido por compartir públicamente sus rutinas MATLAB “Simple Tracker”.
Materials
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
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