لوسيفر الأصفر - علامة نفاذية شبه خلوية قوية في نموذج خلية من حاجز الدم في الدماغ البشري
Summary
نقدم اختبار الفلورة لإثبات أن لوسيفر الأصفر (LY) هو علامة قوية لتحديد نفاذية شبه الخلايا الظاهرة من الخلايا أحادية hCMEC /D3، وهو نموذج في المختبر من حاجز الدم والدماغ البشري. استخدمنا هذا الفحص لتحديد حركية تشكيل أحادي الطبقات في خلايا hCMEC/D3 المستزرعة.
Abstract
يتكون حاجز الدم في الدماغ BBB من الخلايا البطانية التي تشكل حاجزا بين الدورة الدموية الجهازية والدماغ لمنع تبادل الأيونات غير الضرورية والمواد السامة. تقاطعات ضيقة (TJ) ختم فعال الفضاء شبه الخلوية في الطبقات الأحادية مما أدى إلى حاجز سليمة. تصف هذه الدراسة فحص الفلورة القائم على LY التي يمكن استخدامها لتحديدمعامل نفاذية واضحة (P التطبيق) وبدورها يمكن استخدامها لتحديد حركية تشكيل الطبقات الأحادية المطابقة وتقاطع ضيق الناتجة سلامة الحاجز في الطبقات الأحادية hCMEC/D3. كما نبرهن على فائدة إضافية من هذا الاختبار لتحديد السلامة الوظيفية TJ في الخلايا المنقولة. بياناتنا من LY Pالتطبيق فحص يظهر أن الخلايا hCMEC / D3 البذر في إعداد transwell تحد بشكل فعال LY النقل شبه الخلوي 7 أيام بعد الثقافة. كفائدة إضافية من فحص المقدمة، ونحن نثبت أيضا أن نقل الجسيمات النانوية الحمض النووي لا يغير LY النقل شبه الخلوي في الطبقات الأحادية hCMEC/D3.
Introduction
حاجز الدم في الدماغ (BBB) هو الحاجز الوقائي الذي يحد من تدفق مكونات البلازما إلى أنسجة الدماغ ويتكون من خلايا بطانة الدماغ جنبا إلى جنب مع الخلايا الداعمة مثل pericytes. الدور الرئيسي لBBB هو أن تكون بمثابة الحاجز الذي يختم المسافة بين الدم المحيطي والجهاز العصبي المركزي (CNS) للحفاظ على الهيموسات من البيئة الدقيقة العصبية1،2. الخلايا البطانية الشعرية في الدماغ ختم المسار شبه الخلوي بشكل فعال عن طريق تشكيل تقاطعات ضيقة بين الخلايا (TJs)1. هذا الحاجز الواقي يسمح الجلوكوز والمواد الغذائية المختارة لدخول الدماغ في حين أنه يمنع غالبية الأيونات والمواد السامة والأدوية من المرور من خلال هذا الحاجز الضيق. وإلى جانب الدور الوقائي الذي يضطلع به المكتب، فإن وظيفة الحاجز الطبيعي لـ BBB تشكل تحديا ً شديداً في تطوير نظم إيصال المخدرات التي تستهدف الجهاز العصبي المركزي.
في المختبر نماذج زراعة الخلايا من BBB هي أدوات مفيدة لدراسة البيولوجيا وفهم آثار العلاج من المخدرات على سلامة حاجز TJ. استخدمنا خط الخلايا البطانية الأوعية الدموية المجهرية الدماغية البشرية (hCMEC/D3) كنموذج في المختبر لأنه نموذج مقبول من بطانة الدماغ البشري3 ويلخص العديد من وظائف BBB البشرية. hCMEC /D3is واحدة من خطوط الخلايا الأكثر استخداما لنمذجة BBB في المختبر4،5،6،7،8،9. على الرغم من قيمها المنخفضة نسبيا من المقاومة الكهربائية عبر الانعندوات (TEER)، وهو مقياس لضيق الحاجز، يحتفظ هذا الخط الخلوي بمعظم الخصائص المورفولوجية والوظيفية للخلايا البطانية الدماغية، حتى كثقافة أحادية في غياب الخلايا الغليفية المشتركة الثقافة6،7. خط الخلية hCMEC /D3 يعبر عن علامات BBB متعددة بما في ذلك الناقلين النشطين والمستقبلات حتى مرور ما يقرب من 35 دون الخضوع للتمييز إلى الأنماط الظاهرية غير المستقرة6و7و9 ،10،11. السمة الأكثر لفتا للانتباه من خط الخلية hCMEC / D3 كنموذج BBB في المختبر هو قدرته على تشكيل TJs5،9،11،12. وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن نماذج BBB المشتقة من الخلايا الجذعية أظهرت نفاذية أعلى في العديد من الدراسات مقارنة مع خط الخلية hCMEC/D3 وأنها لا تعبر عن بعض علامات BBB، فإنها لم تتطور بعد كنموذج الخلية BBB الأكثر شيوعا13. الأهم من ذلك، لا تزال نماذج BBB المشتقة من الخلايا الجذعية تتميز فيما يتعلق بأرقام المرور القصوى التي تسمح للخلايا للحفاظ على الأنماط الظاهرية BBB مستقرة14.
وتستخدم عادة ثلاث طرق أولية لتحديد سلامة حاجز TJ، بما في ذلك قياس TEER،وقياس معامل نفاذية واضح (P التطبيق) من جزيئات التتبع المائية الصغيرة مثل السكروز، الإينولين، لوسيفر الأصفر، الخ والمناعة من علامات الجزيئية المعروفة من TJs مثل claudin-5، ZO-1، occludin، الخ5. TEER هو طريقة بسيطة نسبيا وكمية أن يقيس المقاومة الكهربائية عبر أحاديةالخلية المستزرعة على الركيزة غشاء مسامية 5. ومع ذلك، يمكن أن تتأثر قيم TEER بالمتغيرات التجريبية مثل تكوين وسط الثقافة ونوع أداة القياس. مزيج محتمل من هذه العوامل يؤدي إلى توزيع واسع من قيم TEER تتراوح بين 2 إلى 1150 Ω سم2 في خط الخلية hCMEC /D3 المستزرعة لمدة 2-21 يوما13. تلطيخ المناعة هو طريقة بصرية لتحديد وجود بروتينات TJ عن طريق وضع العلامات على البروتين المستهدف باستخدام الأجسام المضادة. ومع ذلك، ينطوي التلطيخ المناعي على سلسلة من الخطوات التجريبية، بما في ذلك الحاجة إلى إصلاح/نفاذية الخلايا التي قد تؤدي إلى قطع أثرية تجريبية وإشارات الفلورسنت قد تتلاشى مع مرور الوقت. قد تؤدي العوامل المذكورة أعلاه إلى أخطاء ذاتية تؤثر على جودة البيانات.
التركيز الرئيسي لهذا العمل هو تقديم فحص نفاذية واضحة تستند إلى LY تحديد حركية تشكيل أحادي الطبقات المنافي في الخلايا المستزرعة hCMEC/D3. على الرغم من أن أنظمة BBB المتقدمة الأخرى في المختبر، مثل أنظمة الثقافة المشتركة، وأنظمة السوائل الدقيقة، هي من الناحية الفسيولوجية أكثر أهمية يحاكي مع وظيفة حاجز تحسنت بشكل كبير15،16،17،hCMEC /D3 transwell الإعداد هو نموذج بسيط وموثوق بها لتقدير حركية تشكيل TJ وفرز بسرعة تأثير تركيبات المخدرات المختلفة على وظيفة الحاجز. بشكل عام، قيمالتطبيق P متسقة لمختلف solutes المائية في الطبقات الأحادية hCMEC/D3. على سبيل المثال، قيمالتطبيق P المبلغ عنها لمختلف solutes الكتلة الجزيئية المنخفضة المختلفة (مثل السكروز، مانيتول، LY، الخ) في مختلف نماذج BBB في المختبر هي في ترتيب 10-4 سم / دقيقة5،18،19 , 20.في الإعداد التجريبي لدينا، يتم بذر الخلايا البطانية الدماغ على غشاء ميكرومبوروس المغلفة بالكولاجين لتعلق الخلية وتشكيل أحادية الطبقة لتقليد الحاجز في الجسم الحي. وأضاف LY في الجانب apical ومن المتوقع أن اجتياز التقاطعات الضيقة بين الخلايا وتتراكم في الجانب الباضلي. وتشير تركيزات أكبر من LY في الجانب الباضيلي إلى وجود حاجز غير ناضج وغير عملي بالكامل، في حين تعكس التركيزات المنخفضة النقل المقيد بسبب وجود TJs وظيفية مما يؤدي إلى حاجز ناضج.
LY هو صبغة مائية مع قمم الإثارة / الانبعاثات متميزة ويتجنب الحاجة إلى جزيئات تتبع العلامة الراديوية مثل السكروز، مانيتول أو الإينولين. وهكذا، يمكن استخدام قيم الفلورة من LY لحساب نفاذية شبه الخلوية مباشرة عبر الطبقات الأحادية BBB. أيضا، بالمقارنة مع العديد من الأصباغ المتاحة تجاريا المستخدمة في المجالات الطبية الحيوية التي تعاني من التحولات ستوكس الصغيرة مثل الفلورسين21،تحول ستوكس من LY حوالي 108 نانومتر مع فصل الطيفية كافية، مما يسمح LY البيانات الفلورية باعتبارها قراءة قوية لتحديد نفاذية شبه الخلوية. استخدمنا النشاف الغربي كتقنية متعامدة لإظهار التغيرات في التعبير عن البروتين علامة تقاطع ضيق، ZO-1، على مدى وقت الثقافة. يتم استخدام التعبير ZO-1 الكشف عن طريق النشاف الغربية لتكملة بياناتالتطبيق LY P وجنبا إلى جنب، وتشير هذه البيانات إلى أن التغييرات التي لوحظت في قيمالتطبيق LY P يعكس تشكيل طبقة أحادية مع زيادة تدريجية في التعبير عن علامة تقاطع ضيق، ZO-1.
وكما أشير في وقت سابق، فإن التركيز الرئيسي لهذا العمل هو إظهار اختبار LY كتقنية بسيطة لرصد تشكيل طبقة أحادية المنافية مع تقاطعات ضيقة وظيفية. ومع ذلك، لإظهار فائدة إضافية من اختبار المتقدمة، قمنا بقياسالتطبيق LY P في الحمض النووي نانوجسيم transfecd hCMEC / D3 أحادية الطبقات. يمكن تكثيف الأحماض النووية في جسيمات نانوية متعددة الكهرباء بقطر 100-200 نانومتر عن طريق التفاعل الكهروستاتيكي بين مجموعات البوليمرات المشحونة بشكل إيجابي ومجموعات الفوسفات المشحونة سلبا من الأحماض النووية22، 23.نشير إلى هذه المجمعات كجسيمات نانوية الحمض النووي (DNA NPs) في عملنا. في حين أن نيتنا هي نقل الخلايا والتعبير عن البروتين المطلوب، يجب علينا أن نضمن عدم المساس بخصائص الحاجز من الطبقات الأحادية hCMEC/D3. تشير بياناتنا إلى أن نظام الانف الجيني القياسي 4 h luciferase لا يغير بشكل ملموس نفاذية LY مما يدل على فائدة اختبارالتطبيق LY P لتحديد التغييرات في سلامة حاجز TJ.
Protocol
Representative Results
Discussion
دور رئيسي لBBB هو منع تبادل الأيونات غير الضرورية والمواد السامة بين الدورة الدموية الجهازية والدماغ للحفاظ على انحلال البيئة الدقيقة العصبية. واحدة من السمات المميزة لBBB هو قدرة الخلايا البطانية الشعرية لتشكيل تقاطعات ضيقة (TJs) التي ختم على نحو فعال الطريق شبه الخلوي للنقل. أظهرنا فحصال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفون على الدعم المالي المقدم من جائزة المحقق الجديد لعام 2017 من الرابطة الأمريكية للصيدلية، وجائزة هوكلمني للأمراض المخيفة من جامعة دوكين، وأموال بدء كلية الصيدلة لمختبر مانيكام. نود أن نشكر مختبر تسرب (جامعة Duquesne) للمساعدة الغربية النشاف والسماح باستخدام الصور أوديسي 16 بت. ونود أيضا أن ندرج مذكرة تقدير خاصة لكاندارب ديف (مختبر مانيكام) للمساعدة في النشاف الغربية.
Materials
| hCMEC/D3 cell line | Cedarlane Laboratories | 102114.3C-P25 | human cerebral microvascular endothelial cell line |
| gWizLuc | Aldevron | 5000-5001 | Plasmid DNA encoding luciferase gene |
| lucifer yellow CH dilithium salt | Invitrogen | 155267 | |
| Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes | Falcon | 353095 | |
| Tissue culture flask | Olympus Plastics | 25-207 | |
| 24-well Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-107 | |
| Black 96-Well Immuno Plates | Thermo Scientific | 437111 | |
| S-MEM 1X | Gibco | 1951695 | Spinner-minimum essential medium (S-MEM) |
| EBM-2 | Clonetics | CC-3156 | Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) |
| phosphate-buffered saline 1X | HyClone | SH3025601 | |
| Collagen Type I | Discovery Labware, Inc. | 354236 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Cell Culture Lysis 5X Reagent | Promega | E1531 | |
| Beetle Luciferin, Potassium Salt | Promega | E1601 | |
| SpectraMax i3 | Molecular Devices | Fluorescence Plate Reader | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher | 61-7300 | |
| anti-GAPDH antibody | abcam | ab8245 | |
| Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) | Jackson ImmunoResearch Inc | 128817 | |
| 12-well, Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-106 | |
| RIPA buffer (5X) | Alfa Aesar | J62524 | |
| Aprotinin | Fisher BioReagents | BP2503-10 | |
| Odyssey CLx imager | LI-COR Biosciences | for scanning western blot membranes |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Camos, S., Mallolas, J. Experimental models for assaying microvascular endothelial cell pathophysiology in stroke. Molecules. 15 (12), 9104-9134 (2010).
- Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
- Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (9), 2727-2746 (2015).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
- Tornabene, E., Brodin, B. Stroke and Drug Delivery–In vitro Models of the Ischemic Blood-Brain Barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (2), 398-405 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Llombart, V., et al. Characterization of secretomes from a human blood brain barrier endothelial cells in-vitro model after ischemia by stable isotope labeling with aminoacids in cell culture (SILAC). Journal of Proteomics. 133, 100-112 (2016).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Avdeef, A. How well can in vitro brain microcapillary endothelial cell models predict rodent in vivo blood-brain barrier permeability?. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 43 (3), 109-124 (2011).
- Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
- Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), e99733 (2014).
- Shao, X., et al. Development of a blood-brain barrier model in a membrane-based microchip for characterization of drug permeability and cytotoxicity for drug screening. Analytica Chimica Acta. 934, 186-193 (2016).
- Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).
- Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood–brain barrier. Advanced Drug Delivery Reviews. 36, (1999).
- Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood–brain barrier in drug discovery and development. Nature reviews Drug discovery. 6 (8), 650 (2007).
- Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. . The Blood-Brain Barrier. , 307-324 (2003).
- Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability Studies on In vitro Blood–Brain Barrier Models: Physiology, Pathology, and Pharmacology. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
- Ren, T. B., et al. A General Method To Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures. Journal of the American Chemical Society. 140 (24), 7716-7722 (2018).
- Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).
- Oupický, D., Konák, C., Ulbrich, K., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers. Journal of Controlled Release. 65, (2000).
- Couraud, P. O. . The hCMEC/D3 CELL LINE: IMMORTALIZED HUMAN CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS As a model of human Blood-Brain Barrier. , (2012).
- Youdim, K. u. r. e. s. h. A., A, A. A. a. N. J. In vitro trans-monolayer permeability calculations: often forgotten assumptions. research focus reviews. 8, (2003).
- Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluid and Barriers of the CNS. 10 (33), (2013).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
- Balda, M. S., Anderson, J. M. Two classes of tight junctions are revealed by ZO-1 isoforms. The American Physiological Society. , (1992).
- Brown, R. C., Davis, T. P. Calcium Modulation of Adherens and Tight Junction Function: A Potential Mechanism for Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke. Stroke. 33 (6), 1706-1711 (2002).
- Gorodeski, G., Jin, W., Hopfer, U. Extracellular Ca2+ directly regulates tight junctional permeability in the human cervical cell line CaSki. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 272 (2), C511-C524 (1997).
- Stuart, R. O., Sun, A., Panichas, M., Hebert, S. C., Brenner, B. M., Nigam, S. K. Critical Role for lntracellular Calcium in Tight Junction Biogenesis. Journal of Cellular Physiology. 159, (1994).
- Tobey, N. A. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. , (2004).
- Tobey, N. A., Argote, C. M., Hosseini, S. S., Orlando, R. C. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 286, (2004).
- Posimo, J. M., et al. Viability assays for cells in culture. Journal of visualized experiments : JoVE. (83), e50645 (2014).
- Cipolla, M. J., Crete, R., Vitullo, L., Rix, R. D. Transcellular transport as a mechanism of blood-brain barrier disruption during stroke. Frontiers in Bioscience. 9 (3), 777-785 (2004).
- Kreuter, J. Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain. Journal of nanoscience and nanotechnology. 4 (5), 484-488 (2004).
- Markoutsa, E., et al. Uptake and permeability studies of BBB-targeting immunoliposomes using the hCMEC/D3 cell line. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (2), 265-274 (2011).
