ルシファーイエロー - ヒト血液脳関門の細胞モデルにおける堅牢な細胞透過性マーカー
Summary
我々は、ルシファーイエロー(LY)がヒト血液脳関門のインビトロモデルであるhCMEC/D3細胞単層の明らかな細胞透過性を決定する堅牢なマーカーであることを実証するために蛍光アッセイを提示する。このアッセイを用いて、培養hCMEC/D3細胞におけるコンフルエント単層形成の動態を決定した。
Abstract
血液脳関門BBBは、全身循環と脳の間の障壁を形成する内皮細胞からなる非必須イオンと有毒物質の交換を防ぐ。タイトジャンクション(TJ)は、単層の準細胞空間を効果的にシールし、そのままのバリアを生み出します。本研究では、LYベースの蛍光アッセイを用いて、その明らかな透過性係数(Pアプリ)を決定し、次にコンフルエント単層の形成と得られたタイトジャンクションの動態を決定するために使用することができる。hCMEC/D3単層におけるバリアの完全性。我々はさらに、トランスフェクト細胞におけるTJ機能完全性を決定するために、このアッセイの追加の有用性を実証する。LY Pアプリアッセイからの我々のデータは、トランスウェルセットアップで播種されたhCMEC/D3細胞が効果的にLY細胞輸送7日後培養を制限することを示しています。提示されたアッセイの付加的な有用性として、我々はまた、DNAナノ粒子トランスフェクションがhCMEC/D3単層におけるLY細胞細胞輸送を変化しないことを実証する。
Introduction
血液脳関門(BBB)は、脳組織への血漿成分の流入を制限する保護障壁であり、脳内皮細胞とペリサイトなどの支持細胞からなる。BBBの主な役割は、神経微小環境1、2の血球を維持するために末梢血と中枢神経系(CNS)の間の空間を密封する障壁として機能する。脳毛細血管内皮細胞は、細胞間タイトジャンクション(TJs)1の形成を介して細胞間経路を効果的にシールする。この保護バリアは、ブドウ糖と選択された栄養素が脳に入ることを可能にする一方で、イオン、有毒物質、薬物の大部分がこのタイトな障壁を通過するのを防ぎます。その保護的役割とは別に、BBBの自然なバリア機能は、CNSを標的とする薬物送達システムの開発において深刻な課題を提起する。
BBBのインビトロ細胞培養モデルは、その生物学を研究し、TJバリア完全性に対する薬物治療の影響を理解するのに役立つツールです。ヒト脳内皮細胞株(hCMEC/D3)をインビトロモデルとして用いたのは、ヒト脳内皮3の受け入れモデルであり、ヒトBBBの多くの機能を要約する。hCMEC/D3は、インビトロ4、5、6、7、8、9でBBBをモデリングするための最も一般的に使用される細胞株の一つです。バリア締めの尺度である経体皮電気抵抗(TEER)の比較的低い値にもかかわらず、この細胞株は脳内皮細胞の形態的および機能的特性のほとんどを保持し、共培養グリア細胞6,7.hCMEC/D3細胞株は、不安定な表現型6、7、9に脱分化を受けることなく、約35経過まで、活性トランスポーターおよび受容体を含む複数のBBBマーカーを発現する 、10、11.インビトロBBBモデルとしてのhCMEC/D3細胞株の最も顕著な特徴は、TJs5、9、11、12を形成する能力です。幹細胞由来BBBモデルは、hCMEC/D3細胞株と比較して多くの研究において高い透過性を示し、いくつかのBBBマーカーを発現するが、それらは最も一般的なBBB細胞モデル13としてまだ進化していない。重要なことに、幹細胞由来BBBモデルは、細胞が安定したBBB現象型14を維持することを可能にする最大通過数に関して特徴付けされたままである。
一般的に、TEERの測定、スクロース、イヌリン、ルシファーイエローなどの小さな親水性トレーサー分子の見かけ透過性係数(Pアプリ)の測定を含む、TJバリアの完全性を決定するために一般的に使用されています。クラウディン-5、ZO-1、オクルージン等のTJの既知の分子マーカーの免疫染色等5.TEERは、多孔質膜基板上で培養された細胞単層全体の電気抵抗を測定する比較的単純で定量的な方法5である。しかし、TEER値は培養培地の組成や測定器の種類などの実験変数の影響を受ける可能性があります。これらの因子の組み合わせは、2〜21日間培養されたhCMEC/D3細胞株において、2~1150 Ω cm2までのTEER値の広範な分布につながる。免疫染色は、抗体を用いて標的タンパク質を標識することによりTJタンパク質の存在を決定する視覚的方法である。しかし、免疫染色は、実験的なアーティファクトをもたらす可能性のある細胞を固定/透過する必要性を含む一連の実験ステップを伴い、蛍光シグナルは時間の経過とともに消えてしまいます。上記の要因は、データ品質に影響を与える主観的なエラーにつながる可能性があります。
本研究の主な焦点は、培養hCMEC/D3細胞におけるコンフルエント単層形成の動態を決定するLYベースの明らかな透過性アッセイを提示することである。共培養システム、マイクロ流体システムなどの他の高度なインビトロBBBシステムは、大幅に改善されたバリア機能15、16、17、hCMEC/D3を有する生理学的に関連性の高い模倣であるトランスウェルセットアップは、TJ形成の動態を推定し、バリア機能に対する異なる薬物製剤の効果を迅速にスクリーニングするためのシンプルで信頼性の高いモデルです。一般に、Pアプリ値は、hCMEC/D3単層における様々な親水性溶媒に対して一貫しています。例えば、インビトロBBBモデルにおける様々な低分子量溶質(スクロース、マンニトール、LYなど)に対する報告されたPアプリ値は、10-4 cm/min 5、18、19の順に示されます。,20.我々の実験セットアップでは、脳内皮細胞は、細胞の付着および単層形成のためのコラーゲンコーティングされた微多孔質膜上に播種され、生体内の障壁を模倣する。頂点側に添加されたLYは、細胞間のタイトジャンクションを横断し、側側に蓄積することが期待される。側側のLYの濃度が高いほど、未熟で完全に機能しない障壁を示し、低濃度は成熟した障壁をもたらす機能的なTJの存在による制限された輸送を反映する。
LYは、明確な励起/発光ピークを有する親水性染料であり、スクロース、マンニトールまたはイヌリンなどの放射ラベルトレーサー分子の必要性を回避します。したがって、LYの蛍光値は、BBB単層全体のその準細胞透過性を直接計算するために使用することができる。また、フルオレセイン21などの小さなストークスシフトに苦しむ生物医学分野で使用される多くの市販の染料と比較して、LYのストークスシフトは、十分なスペクトル分離を有する約108nmであり、したがって、LY蛍光データを細胞細胞透過性を決定するための堅牢な読み出し。我々は、培養時間にわたってタイトジャンクションマーカータンパク質ZO-1の発現の変化を実証するために、直交技術としてウェスタンブロッティングを使用した。ウェスタンブロッティングを介して検出されたZO-1式は、LY Pアプリデータを補完するために使用され、組み合わせることで、これらのデータは、LY Pアプリ値の観察された変化が、徐々に増加する単層の形成を反映していることを示唆している。タイトジャンクションマーカー、ZO-1の表現。
先に指摘したように、この研究の中心的な焦点は、機能的なタイトジャンクションを持つコンフルエント単層の形成を監視する簡単な技術としてLYアッセイを実証することです。しかし、開発されたアッセイのさらなる有用性を実証するために、DNAナノ粒子トランスフェクトhCMEC/D3単層におけるLY Pアプリを測定した。核酸は、正に帯電したポリマー群と核酸22の負に帯電したリン酸基との間の静電相互作用を介して、直径100〜200nmのポリ電解質ナノ粒子に凝縮することができる。23.これらの複合体をDNAナノ粒子(DNADNA)と呼んでいます。私たちの意図は、細胞をトランスフェクトし、所望のタンパク質を発現することですが、hCMEC/D3単層のバリア特性が損なわれないようにする必要があります。我々のデータは、標準的な4時間ルシフェラーゼ遺伝子トランスフェクション体制が、TJバリア完全性の変化を決定するためにLY Pアプリアッセイの有用性を実証するLY透過性を測定可能に変化しないことを示唆している。
Protocol
Representative Results
Discussion
BBBの重要な役割は、神経微小環境の無血症を維持するために、全身循環と脳との間の非必須イオンおよび有害物質の交換を防止することです。BBBの特徴の一つは、毛細血管内皮細胞が輸送の準細胞経路を効果的に密封するタイトジャンクション(TJ)を形成する能力である。培養hCMEC/D3単層におけるTJバリア形成の明らかな動態を決定する定量的方法としてのLY Pアプリアッセイを実証し?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、米国薬学会の2017年新研究者賞、デュケイン大学のハンケル恐れ病賞、マニッカム研究所の薬学部のスタートアップファンドからの財政的支援に感謝しています。私たちは、リーク研究所(デュケスネ大学)の西洋のブロッティング支援とオデッセイ16ビットイメージャーの使用を許可してくれたことに感謝します。また、カンダルプ・デイブ(マニッカム研究所)に対する感謝の気持ちを、西洋のブロッティングの助けを借りておきたい。
Materials
| hCMEC/D3 cell line | Cedarlane Laboratories | 102114.3C-P25 | human cerebral microvascular endothelial cell line |
| gWizLuc | Aldevron | 5000-5001 | Plasmid DNA encoding luciferase gene |
| lucifer yellow CH dilithium salt | Invitrogen | 155267 | |
| Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes | Falcon | 353095 | |
| Tissue culture flask | Olympus Plastics | 25-207 | |
| 24-well Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-107 | |
| Black 96-Well Immuno Plates | Thermo Scientific | 437111 | |
| S-MEM 1X | Gibco | 1951695 | Spinner-minimum essential medium (S-MEM) |
| EBM-2 | Clonetics | CC-3156 | Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) |
| phosphate-buffered saline 1X | HyClone | SH3025601 | |
| Collagen Type I | Discovery Labware, Inc. | 354236 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Cell Culture Lysis 5X Reagent | Promega | E1531 | |
| Beetle Luciferin, Potassium Salt | Promega | E1601 | |
| SpectraMax i3 | Molecular Devices | Fluorescence Plate Reader | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher | 61-7300 | |
| anti-GAPDH antibody | abcam | ab8245 | |
| Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) | Jackson ImmunoResearch Inc | 128817 | |
| 12-well, Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-106 | |
| RIPA buffer (5X) | Alfa Aesar | J62524 | |
| Aprotinin | Fisher BioReagents | BP2503-10 | |
| Odyssey CLx imager | LI-COR Biosciences | for scanning western blot membranes |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Camos, S., Mallolas, J. Experimental models for assaying microvascular endothelial cell pathophysiology in stroke. Molecules. 15 (12), 9104-9134 (2010).
- Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
- Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (9), 2727-2746 (2015).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
- Tornabene, E., Brodin, B. Stroke and Drug Delivery–In vitro Models of the Ischemic Blood-Brain Barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (2), 398-405 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Llombart, V., et al. Characterization of secretomes from a human blood brain barrier endothelial cells in-vitro model after ischemia by stable isotope labeling with aminoacids in cell culture (SILAC). Journal of Proteomics. 133, 100-112 (2016).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Avdeef, A. How well can in vitro brain microcapillary endothelial cell models predict rodent in vivo blood-brain barrier permeability?. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 43 (3), 109-124 (2011).
- Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
- Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), e99733 (2014).
- Shao, X., et al. Development of a blood-brain barrier model in a membrane-based microchip for characterization of drug permeability and cytotoxicity for drug screening. Analytica Chimica Acta. 934, 186-193 (2016).
- Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).
- Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood–brain barrier. Advanced Drug Delivery Reviews. 36, (1999).
- Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood–brain barrier in drug discovery and development. Nature reviews Drug discovery. 6 (8), 650 (2007).
- Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. . The Blood-Brain Barrier. , 307-324 (2003).
- Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability Studies on In vitro Blood–Brain Barrier Models: Physiology, Pathology, and Pharmacology. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
- Ren, T. B., et al. A General Method To Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures. Journal of the American Chemical Society. 140 (24), 7716-7722 (2018).
- Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).
- Oupický, D., Konák, C., Ulbrich, K., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers. Journal of Controlled Release. 65, (2000).
- Couraud, P. O. . The hCMEC/D3 CELL LINE: IMMORTALIZED HUMAN CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS As a model of human Blood-Brain Barrier. , (2012).
- Youdim, K. u. r. e. s. h. A., A, A. A. a. N. J. In vitro trans-monolayer permeability calculations: often forgotten assumptions. research focus reviews. 8, (2003).
- Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluid and Barriers of the CNS. 10 (33), (2013).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
- Balda, M. S., Anderson, J. M. Two classes of tight junctions are revealed by ZO-1 isoforms. The American Physiological Society. , (1992).
- Brown, R. C., Davis, T. P. Calcium Modulation of Adherens and Tight Junction Function: A Potential Mechanism for Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke. Stroke. 33 (6), 1706-1711 (2002).
- Gorodeski, G., Jin, W., Hopfer, U. Extracellular Ca2+ directly regulates tight junctional permeability in the human cervical cell line CaSki. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 272 (2), C511-C524 (1997).
- Stuart, R. O., Sun, A., Panichas, M., Hebert, S. C., Brenner, B. M., Nigam, S. K. Critical Role for lntracellular Calcium in Tight Junction Biogenesis. Journal of Cellular Physiology. 159, (1994).
- Tobey, N. A. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. , (2004).
- Tobey, N. A., Argote, C. M., Hosseini, S. S., Orlando, R. C. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 286, (2004).
- Posimo, J. M., et al. Viability assays for cells in culture. Journal of visualized experiments : JoVE. (83), e50645 (2014).
- Cipolla, M. J., Crete, R., Vitullo, L., Rix, R. D. Transcellular transport as a mechanism of blood-brain barrier disruption during stroke. Frontiers in Bioscience. 9 (3), 777-785 (2004).
- Kreuter, J. Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain. Journal of nanoscience and nanotechnology. 4 (5), 484-488 (2004).
- Markoutsa, E., et al. Uptake and permeability studies of BBB-targeting immunoliposomes using the hCMEC/D3 cell line. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (2), 265-274 (2011).
