Identificeren van celoppervlak markeringen van primaire neurale stam en voorlopercellen door metabole labeling van Sialoglycan
Summary
Gepresenteerd hier is een protocol dat combineert een in vitro neurale-endotheliale co-cultuur systeem en metabole opname van sialoglycan met bioorthogonal functionele groepen uit te breiden primaire zenuw stam en voorlopercellen en label hun oppervlak sialoglycoproteïnen voorbeeld vorming of massaspectrometrie analyse van celoppervlak markeringen.
Abstract
Neurale stam-en voorlopercellen (Nspc’s) zijn de cellulaire basis voor de complexe structuren en functies van de hersenen. Ze bevinden zich in gespecialiseerde niches in vivo en kunnen worden geïsoleerd en uitgebreid in vitro, dienen als een belangrijke bron voor celtransplantatie om hersenbeschadiging te herstellen. Nspc’s zijn echter heterogene en niet duidelijk gedefinieerd op moleculair niveau of gezuiverd als gevolg van een gebrek aan specifieke celoppervlak markeringen. Het gepresenteerde protocol, dat eerder is gerapporteerd, combineert een neurale-endothelial co-cultuur systeem met een metabole ontwikkelen-etiketterings methode om het oppervlak sialoglycoproteome van primaire nspc’s te identificeren. Het NSPC-endotheliale co-cultuur systeem maakt zelf vernieuwing en uitbreiding van primaire Nspc’s in vitromogelijk, waardoor een voldoende aantal nspc’s worden gegenereerd. Sialoglycans in gekweekte nspc’s zijn gelabeld met behulp van een onnatuurlijke sialic acid metabole reporter met bioorthogonale functionele groepen. Door het sialoglycoproteome te vergelijken met zelfverlengde Nspc’s die in een endotheliale co-cultuur met differentiërende neurale cultuur zijn uitgebreid, identificeren we een lijst van membraan eiwitten die verrijkt zijn met Nspc’s. In detail omvat het Protocol: 1) het opzetten van een NSPC-endotheliale co-cultuur en NSPC-differentiërende cultuur; 2) etikettering met azidosugar per-O-geacetoneerde N-azidoacetylmannosamine (AC4Mannaz); en 3) Biotine conjugatie aan gemodificeerde sialoglycan voorbeeld vorming na fixatie van neurale cultuur of EiwitExtractie uit neurale cultuur voor massaspectrometrie analyse. Vervolgens worden de NSPC-verrijkte oppervlak marker kandidaten geselecteerd door vergelijkende analyse van massaspectrometrie gegevens uit zowel de uitgebreide NSPC en gedifferentieerde neurale culturen. Dit protocol is zeer gevoelig voor het identificeren van membraan eiwitten van geringe overvloed in de uitgangsmaterialen, en het kan worden toegepast op marker ontdekking in andere systemen met passende modificaties
Introduction
Neurale stamcellen worden gedefinieerd als een multipotente celpopulatie die zichzelf kan verlengen om een stamcel zwembad te behouden en zich te differentiëren in neuronen en gliacellen. Ze zijn de belangrijkste celtypen in het zenuwstelsel en kunnen een groot therapeutisch potentieel bieden in regeneratieve geneeskunde door middel van celtransplantatie in zieke en gewonde hersenen1,2. Naarmate de ontwikkeling vordert, wordt de neurale stamcel populatie heterogene3,4, en het aandeel van neurale stamcellen in de hersenen neemt geleidelijk af5. Over het algemeen bevinden embryonale stamcellen en andere neurale voorlopercellen, gezamenlijk neurale stam-en voorlopercellen (Nspc’s), zich in de Germinal zones, de ventriculaire zone en de subventriculaire zone bij muizen6. In het embryonale brein genereren neurale stamcellen direct of indirect neuronen via tussenliggende voorlopercellen (ipc’s), en in sommige soorten door de buitenste subventriculaire zone-voor ouders (orgs)7,8. De specifieke moleculaire handtekening, morfologie, locatie in de stamcel niche en differentiatie potentieel bepalen allemaal de rol van elk subtype in hersen organogenese en klinische toepassingen9. De momenteel beschikbare celoppervlak markeringen kunnen echter niet ondubbelzinnig verschillende subtypen van Nspc’s discrimineren en zuiveren, waardoor het begrip en het gebruik van deze subtypen worden beperkt.
De identificatie van primaire NSPCs-oppervlak markeringen wordt beperkt door drie grote hindernissen. De eerste is het beperkte celnummer van Nspc’s in het weefsel, waardoor het moeilijk is om celoppervlakte proteïne monsters voor te bereiden voor gemeenschappelijke massaspectrometrie analyse. De tweede beperking is de moeilijkheid bij het produceren van zuivere celsubtypen voor het genereren van subtype-specifieke membraan proteïne gegevens. Ten slotte is de derde uitdaging de lage ratio van celoppervlakte eiwitten in hele celeiwitten, wat hun detectie gevoeligheden belemmert door massaspectrometrie analyse.
Om deze problemen te overwinnen, ontwikkelden we een chemoproteomische benadering om celoppervlakte eiwitten in primaire Nspc’s selectief te verrijken en te identificeren door de sialoglycoproteïnen10metabolisch te labelen. Om een voldoende aantal Nspc’s te genereren, maakten we gebruik van een vastgesteld protocol om de primaire embryonale Nabc’s in ongedifferentieerde toestanden uit te breiden en te handhaven in vitro, door het coculeren van Nspc’s met muizen hersen endotheliale cellijnen met behulp van een permeabele ondersteuning matrix insert (bijv. trans well) systeem11. In tegenstelling, npscs gekweekt alleen zonder endotheel cellen genereren gedifferentieerde nageslacht11,12. Zo kunnen eiwit monsters van deze twee kweeksystemen relatief worden geanalyseerd om eiwitten te identificeren die differentieel uitgedrukt zijn in Nspc’s en gedifferentieerde neuronen. Aangezien de meeste celoppervlakte eiwitten worden gemodificeerd door sialic acid13, onnatuurlijke sialic acid precursor analoge N-azidoacetylmannosamine-tetraacylated (AC4Mannaz) werd gebruikt om de intrinsieke metabole route te kapen, zodat endogene, nieuw gesynthetiseerde sialoglycans zijn gelabeld met meer groepen, het genereren van een chemische handvat14. Via azido-alkyne-gemedieerde bioorthogonale reacties, die biotine aan sialoglycans Conjugeren, kunnen celoppervlakte eiwitten worden gevisualiseerd en verrijkt voor proteomische identificatie door middel van een streptavidine-gekoppelde de of matrix14.
Hier voeren we kleuring van SDS-PAGE gel analyse van het oppervlak sialoglycoproteome uit Nspc’s uitgebreid in een endotheliale co-cultuur en differentiërende cellen in een niet-co-cultuur systeem. We zuiveren ook selectief oppervlak sialoglycoproteome in de twee kweeksystemen voor proteomische vergelijking. Ons protocol, in vergelijking met de traditionele centrifugatie-based cel oppervlakte zuivering protocollen15, verhoogt de extractie werkzaamheid door het verminderen van de oppervlakte-EiwitExtractie procedures door middel van specifieke tag conjugatie en affiniteit Zuivering. Ondertussen, het verhoogt de extractie zuiverheid van celoppervlakte eiwitten op basis van de veronderstelling dat verminderde gebeurt meestal op het celoppervlak eiwitten. Hoewel endotheliale factoren de differentiatie van uitgebreide Nspc’s niet volledig kunnen blokkeren, biedt de vergelijkende studie tussen een co-cultuur en gedifferentieerde cultuur een handige methode om stamcel verrijkte oppervlakte eiwitten te lokaliseren zonder de noodzaak om Analyseer eiwitten uit Npc’s gezuiverd door FACS16. Wij zijn van mening dat deze aanpak kan worden toegepast op onderzoek van oppervlakte eiwitten in andere systemen met de juiste aanpassingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oppervlakte markeringen worden vaak gebruikt om specifieke celtypen in vitro en in vivo17,18te labelen en te zuiveren. De ontdekking van oppervlakte markers levert een grote bijdrage aan regeneratieve geneeskunde en onderzoek door stamcel door moleculaire hulpmiddelen te bieden om een stamcel populatie selectief te verrijken van normale of pathologische weefsels en cultuur gerechten, met een gezuiverde cel bron voor klinisch gebruik of studie van biologische eige…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Figuur 1b, 1C, 1e en 1f zijn overgenomen van Bai et al . 10 met toestemming van de Royal Society of Chemistry. We bedanken Yi Hao in X. C. ‘s Lab voor het bewerken van figuren. Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 91753206 tot Q. S. en X. C., nr. 31371093 naar Q. S., en nrs. 21425204 en 21672013 naar X. C.).
Materials
| BEND3 | ATCC | CRL-229 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 1% |
| Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | 1% |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | 1 to 100 |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A7250 | 1 mM |
| Papain | Worthington | LS003726 | 10 U/mL |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | 1 to 50 |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| basic Fibroblast growth factor | Gibco | PHG0261 | 10 ng/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 1% |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099141 | 10% |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| Tripsin-EDTA, 0.25% | Gibco | 25200056 | |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Transwell | Corning | 3450 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
| Sucrose | Sangon | A100335 | |
| DAPI | Gibco | 62248 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
| SDS-PAGE loading buffer 2X | Solarbio | P1018 | |
| 6-well plate | Corning | 3335 | |
| Tris-Glycine protein gel | invitrogen | xp00100box | |
| mouse monoclonal anti-Nestin | Developmental Study Hybridoma Bank | Rat-401 | 1 to 20 |
| mouse monoclonal anti-beta-tubulin III | Sigma | T8860 | 1 to 1000 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 | invitrogen | A-21121 | 1 to 1000 |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b | invitrogen | A-21143 | 1 to 1000 |
| Albumin Bovine V | Amresco | 0332 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694 | |
| BCA assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Brij97 | Aladdin | B129088 | |
| CuSO4 | Sigma | 209198 | |
| alkyne-biotin | Click Chemistry Tools | TA105 | |
| BTTAA | Click Chemistry Tools | 1236 | |
| Ac4ManNAz | Click Chemistry Tools | 1084 | 100 µM |
| 9AzSia | synthesized in lab | ||
| sodium ascorbate | Sigma | A4034 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| EDTA | Sangon | A100322 | |
| NaCl | Sangon | A100241 | |
| SDS | Sangon | A100227 | |
| Alexa Flour 647-conjugated streptavidin | invitrogen | S21374 | 1 to 1000 |
| Triethanolamine | Sigma | V900257 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | invitrogen | 60210 | |
| ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Thermo Scientific | 20278 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co. | 970-00026-00 | |
| DNase I | Sigma | DN25 | 12 µg/mL |
| urea | Sigma | U5378 |
References
- Weissman, I. L. Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Gage, F. H., Temple, S. Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
- Gal, J. S. Molecular and Morphological Heterogeneity of Neural Precursors in the Mouse Neocortical Proliferative Zones. Journal of Neuroscience. 26, 1045-1056 (2006).
- Kawaguchi, A., et al. Single-cell gene profiling defines differential progenitor subclasses in mammalian neurogenesis. Development. 135, 3113-3124 (2008).
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
- Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139, 1535-1546 (2012).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The Glial Nature of Embryonic and Adult Neural Stem Cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Wang, X., Tsai, J. W., LaMonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nature Neuroscience. 14, 555-561 (2011).
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Bai, Q. R., Dong, L., Hao, Y., Chen, X., Shen, Q. Metabolic glycan labeling-assisted discovery of cell-surface markers for primary neural stem and progenitor cells. Chemical Communications. 54, 5486-5489 (2018).
- Shen, Q., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28, 69-80 (2000).
- Varki, A. Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins. Nature. 446, 1023-1029 (2007).
- Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
- Lin, S. H., Guidotti, G. Purification of Membrane Proteins. Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).
- Schmidt, J. R., et al. Pilot Study on Mass Spectrometry-Based Analysis of the Proteome of CD34+CD123+ Progenitor Cells for the Identification of Potential Targets for Immunotherapy in Acute Myeloid Leukemia. Proteomes. 6, (2018).
- Crisan, M., Dzierzak, E. The many faces of hematopoietic stem cell heterogeneity Development. Development. 144, 4195-4195 (2017).
- Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 14720-14725 (2000).
- Qin, W., et al. Artificial Cysteine S-Glycosylation Induced by Per-O-Acetylated Unnatural Monosaccharides during Metabolic Glycan Labeling. Angewandte Chemie International Edition. , (2018).
- Gry, M., et al. Correlations between RNA and protein expression profiles in 23 human cell lines. BMC Genomics. 10, 365 (2009).
- Hennen, E., et al. A LewisX Glycoprotein Screen Identifies the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) as a Modulator of Oligodendrogenesis in Mice. Journal of Biological Chemistry. 288, 16538-16545 (2013).
- Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 473-483 (2006).
- O’Brian, C. A., Chu, F. ReviewPost-translational disulfide modifications in cell signaling—role of inter-protein, intra-protein, S-glutathionyl, and S-cysteaminyl disulfide modifications in signal transmission. Free Radical Research. 39, 471-480 (2005).
- Williamson, A. J. K., Whetton, A. D. The requirement for proteomics to unravel stem cell regulatory mechanisms. Journal of Cellular Physiology. 226, 2478-2483 (2011).
- Christensen, B., et al. Cell Type-specific Post-translational Modifications of Mouse Osteopontin Are Associated with Different Adhesive Properties. Journal of Biological Chemistry. 282, 19463-19472 (2007).
- Yanagisawa, M., Yu, R. K. The expression and functions of glycoconjugates in neural stem cells. Glycobiology. 17, 57R-74R (2007).
- Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. 생화학. 48, 6571-6584 (2009).
