זיהוי סמני שטח תא של גזע עצבי ראשוני ובתאי מחולל מטבולית על ידי תיוג מטבולי של סילוגליקן

Summary

מוצג כאן הוא פרוטוקול המשלב במערכת התרבותית העצבית-אנדותל ושיתוף תרבות מטבולית והתאגדות המטבולית של sialoglycan עם קבוצות פונקציונליות bioorthogonal כדי להרחיב את גזע הגוף העצבי ואת התאים מחולל מותג התווית שלהם סיליגליקורופנס להדמיה או ניתוח המסה-ספקטרומטריה של סמני שטח התא.

Abstract

תאי גזע ומחולל שדים עצביים הם הבסיס התאי למבנים ולתפקודים המורכבים של המוח. הם ממוקמים נישות מיוחדות ב vivo והוא יכול להיות מבודד ומורחב בתוך מבחנה, משמש כמשאב חשוב עבור השתלת תאים כדי לתקן את הנזק המוחי. עם זאת, NSPCs הם הטרוגנית ולא מוגדר באופן ברור ברמה המולקולרית או מטוהרים בשל חוסר סמנים משטח תא ספציפי. הפרוטוקול המוצג, אשר דווח בעבר, משלבת מערכת משותפת עצבית-שיתוף התרבות עם שיטת התיוג המטבולית, כדי לזהות את המשטח הפנימי של NSPCs הראשי. מערכת התרבות שיתוף הפעולה NSPC-אנדותל מאפשרת חידוש עצמי והתרחבות של NSPCs הראשי בתוך מבחנה, הפקת מספר מספיק של nspcs. סיאלוגליקנים בתרבית nspcs מסומנים באמצעות כתבת מטבולית בלתי טבעית של חומצה סילית עם קבוצות פונקציונליות ביואורתוגונאליות. על ידי השוואת שיתוף הפעולה העצמי מחדש NSPCs התרחב בתרבות האנדותל עם תרבות עצבית מבדילים, אנו מזהים רשימה של חלבונים ממברנה כי הם מועשרים NSPCs. בפירוט, הפרוטוקול כולל: 1) הגדרת תרבות שיתוף NSPC-אנדותל ו-NSPC תרבות הבחנה; 2) תיוג עם אזידוסוכר לפי-או-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac₄mannaz); ו-3) ביוטין ליצירת שינויים בסיקלוגליל לדימות לאחר קיבוע של תרבות עצבית או חילוץ חלבונים מהתרבות העצבית לניתוח הספקטרומטר ההמוני. לאחר מכן, מועמדים לסמן משטח NSPC מועשר נבחרו על ידי ניתוח השוואתי של נתונים ספקטרומטר המוני משני NSPC המורחבת ותרבויות עצביות הבדיל. פרוטוקול זה רגיש מאוד לזיהוי חלבונים ממברנות של שפע נמוך בחומרי ההתחלה, והוא יכול להיות מיושם על גילוי סמן במערכות אחרות עם שינויים מתאימים

Introduction

תאי גזע עצביים מוגדרים כאוכלוסיית תאים רב-עוצמה אשר ניתן לחדש את עצמו כדי לשמור על תא גזע הבריכה להבדיל לנוירונים ו glia. הם סוגי התא העיקריים במערכת העצבים ועשויים להציע פוטנציאל תרפויטי גדול ברפואת ההתחדשות באמצעות השתלת תאים לתוך המוח החולני והפצוע^1,2. כמו התקדמות הפיתוח, האוכלוסיה הגזע העצבי הופך הטרודוגני^3,4, ואת החלק של תאי גזע עצביים במוח בהדרגה יורדת⁵. באופן כללי, תאים גזע עובריים ותאים אחרים העצביים הנוירוני, המכונה בצורה קולקטיבית בתאי גזע ומחולל קדמון (NSPCs), ממוקמים באזורים נבטי, אזור חדרית, ואת אזור subventricular בעכברים⁶. במוח העובריים, תאי גזע עצביים ליצור נוירונים ישירות או בעקיפין באמצעות תאים ביניים מחולל (ipcs), ובמינים מסוימים דרך אזור subventricular החיצוני ושלתי (orgs)^7,8. החתימה המולקולרית הספציפית, המבנה, המיקום בנישה תא הגזע, ופוטנציאל הבידול כולם קובעים את התפקיד של כל תת-סוג באורגנוגנזה ויישומים קליניים⁹. עם זאת, הסמנים הזמינים כרגע תא אינו יכול להפלות באופן חד-משמעי ולטהר סוגים שונים של NSPCs, הגבלת ההבנה והניצול של סוגי משנה אלה.

הזיהוי של סמני פני שטח NSPCs הראשי מוגבל על-ידי שלושה מכשולים עיקריים. הראשון הוא מספר התאים המוגבלים של NSPCs ברקמה, מה שמקשה על הכנת דגימות חלבון פני השטח של התא עבור ניתוח משותף של ספקטרומטר מסה. המגבלה השנייה היא הקושי בהפקת תת תאים טהורים ליצירת תת-סוג של נתוני חלבון ממברנה ספציפיים. לבסוף, האתגר השלישי הוא היחס הנמוך של חלבונים משטח התא בחלבונים תא שלם, אשר הסלים הרגישות שלהם לזיהוי על ידי ניתוח ספקטרומטר המסה.

כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו גישה chemoproteomic באופן סלקטיבי להעשיר ולזהות חלבונים פני השטח של התאים NSPCs הראשי על ידי metabolically תיוג sialoגליקורופנים¹⁰. כדי ליצור מספר מספיק של NSPCs, ניצלנו פרוטוקול מבוסס להרחיב ולתחזק NSPCs העיקרי במצבים מובחן ב מבחנה, על ידי co-culturing NSPCs עם המוח העכבר שורות התאים באמצעות תמיכה חדיר הוספת מטריצה (למשל, transwell) מערכת¹¹. לעומת זאת, NPSCs תרבותי לבדו ללא תאים אנדותל ליצור הבדיל צאצאי^11,12. כך, דגימות חלבונים משתי מערכות התרבות האלה ניתן לנתח באופן מקרי כדי לזהות חלבונים, כי הם מבוטא באופן מהותי NSPCs והבדיל נוירונים. כמו רוב חלבונים פני השטח משתנים על ידי חומצה סילית¹³, חומצה הסילית טבעי אנלוגי מקודמן N-azidoacetylmannosamine-tetraacylated (Ac₄mannaz) שימש לחטוף את השביל הפנימי מטבולית כך אנדוגניים, לאחרונה מסונתז הם מתויגים עם קבוצות azido, יצירת ידית כימית¹⁴. באמצעות azido-אלאלקין-מתווך תגובות bioorthogonal, אשר המשלים ביוטין כדי sialoglycans, תא משטח חלבונים יכול להיות דמיינו ומועשר עבור זיהוי פרוטמית באמצעות מstreptavidin מצמידים fluorophore או מטריקס¹⁴.

כאן, אנו מבצעים צביעת של SDS-דף ניתוח ג’ל של פני השטח של sialoגליקורופאז מ NSPCs התרחב בתרבות שיתוף הפעולה של אנדותל ומבדילים תאים במערכת לא שיתוף תרבות. כמו כן אנו מטהר באופן סלקטיבי את המשטח בשתי מערכות התרבות של השוואה פרוטמית. הפרוטוקול שלנו, לעומת המסורתית צנטריפוגה מבוסס משטח תא פרוטוקולים טיהור¹⁵, מגביר את היעילות החילוץ על ידי הפחתת פני השטח החילוץ הליכי הפקת באמצעות תג מסוים בניינים ואהדה טיהור. בינתיים, זה מגביר את טוהר החילוץ של חלבונים משטח התא בהתבסס על ההנחה כי הסיללציה מתרחשת בעיקר על פני השטח של התאים חלבונים. למרות שגורמי האנדותל אינם יכולים לחסום לחלוטין את הבידול של nspcs מורחב, המחקר השוואתי בין תרבות שותפה ותרבות מובחנת מספק שיטה נוחה כדי לאתר את הזהות המועשרת של תאי גזע מועשר ללא צורך ל לנתח חלבונים מ NPCs מטוהרים על ידי FACS¹⁶. אנו מאמינים גישה זו ניתן להחיל על מחקרים של חלבונים פני השטח במערכות אחרות עם השינויים המתאימים.

Protocol

כל הפרוטוקולים בעלי חיים המשמשים במחקר זה אושרו על ידי IACUC (הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים) של אוניברסיטת Tsinghua והופיע בהתאם להנחיות של IACUC. מתקן חיות המעבדה באוניברסיטת Tsinghua כבר מוכר על ידי AAALAC (האגודה להערכת והסמכה של מעבדה בעלי חיים הבינלאומי טיפול). עבור ההיערכות של עוברים, באמצע היום ש…

Representative Results

ההליך כולו להרחבת מבחנה ותיוג מטבולית של NSPCs העובריים הראשי לוקח 6 ימים (איור 1A). איכות של קו התא BEND3 ו NSPCs הראשי המבודד הטרי הם המפתח לניסוי מוצלח. תאים BEND3 הם המקור של גורמים מסיסים המעוררים חידוש עצמי והתפשטות NSPCs. יש להבטיח כי התאים BEND3 חופשיים של כל זיהום ו?…

Discussion

סמני פני השטח משמשים בדרך כלל לתוויות ולטיהור סוגי תאים ספציפיים במבחנה ובvivo^17,18. גילוי של סמנים פני השטח תורם מאוד לרפואה משובי ומחקרים תא גזע על ידי מתן כלים מולקולריים באופן סלקטיבי להעשיר את האוכלוסייה תא גזע מרקמות נורמלי או פתולוגי מנות תרבות, מציע תא ?…

Materials

BEND3	ATCC	CRL-229
DMEM	Gibco	11960044
L-glutamine	Gibco	25030081	1%
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	1%
N2 supplement	Gibco	17502048	1 to 100
N-acetyl-L-cysteine	Sigma	A7250	1 mM
Papain	Worthington	LS003726	10 U/mL
B27 supplement	Gibco	17504044	1 to 50
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
basic Fibroblast growth factor	Gibco	PHG0261	10 ng/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	1%
Fetal bovine serum	Gibco	10099141	10%
HBSS	Gibco	14175095
Tripsin-EDTA, 0.25%	Gibco	25200056
DPBS	Gibco	14190094
Transwell	Corning	3450
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4%
Sucrose	Sangon	A100335
DAPI	Gibco	62248
RIPA buffer	Thermo Scientific	89900
SDS-PAGE loading buffer 2X	Solarbio	P1018
6-well plate	Corning	3335
Tris-Glycine protein gel	invitrogen	xp00100box
mouse monoclonal anti-Nestin	Developmental Study Hybridoma Bank	Rat-401	1 to 20
mouse monoclonal anti-beta-tubulin III	Sigma	T8860	1 to 1000
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1	invitrogen	A-21121	1 to 1000
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b	invitrogen	A-21143	1 to 1000
Albumin Bovine V	Amresco	0332
Triton X-100	Amresco	0694
BCA assay kit	Thermo Scientific	23225
dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Brij97	Aladdin	B129088
CuSO4	Sigma	209198
alkyne-biotin	Click Chemistry Tools	TA105
BTTAA	Click Chemistry Tools	1236
Ac4ManNAz	Click Chemistry Tools	1084	100 µM
9AzSia	synthesized in lab
sodium ascorbate	Sigma	A4034
Methanol	Sigma	34860
EDTA	Sangon	A100322
NaCl	Sangon	A100241
SDS	Sangon	A100227
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin	invitrogen	S21374	1 to 1000
Triethanolamine	Sigma	V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin	invitrogen	60210
ammonium bicarbonate	Sigma	9830
Coomassie Brilliant Blue R-250	Thermo Scientific	20278
Isoflurane	RWD Life Science Co.	970-00026-00
DNase I	Sigma	DN25	12 µg/mL
urea	Sigma	U5378