Summary

Cellule di Merkel Polyomavirus infezione e rilevamento

Published: February 07, 2019
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Summary

Qui, presentiamo un protocollo per infettare primario fibroblasti cutanei umani con MCPyV. Il protocollo include isolamento dei fibroblasti cutanei, preparazione di virioni di MCPyV, l’infezione del virus, colorazione di immunofluorescenza e fluorescenza l’ibridazione in situ. Questo protocollo può essere esteso per la caratterizzazione di interazioni MCPyV-ospite e scoprire altri tipi di cellule infettabili da MCPyV.

Abstract

Merkel cella polyomavirus (MCPyV) infezione può portare a carcinoma delle cellule di Merkel (MCC), una forma altamente aggressiva di cancro della pelle. Gli studi meccanicistici completamente studiare biologia molecolare MCPyV e meccanismi oncogenici sono stati ostacolati dalla mancanza di modelli della coltura cellulare adeguata. Qui, descriviamo una serie di protocolli per l’esecuzione e la rilevazione dell’infezione di MCPyV delle cellule epiteliali umane primarie. I protocolli descrivono l’isolamento dei fibroblasti cutanei umani, preparazione dei virions MCPyV ricombinante e la rilevazione dell’infezione del virus di colorazione di immunofluorescenza (IF) e reazione a catena del DNA-ibridazione in situ (HCR), che è un altamente sensibile fluorescenza in situ approccio di ibridazione (pesce). I protocolli di questo documento possono essere adattati dai ricercatori interessati per identificare altri tipi di cellule o linee cellulari che supportano MCPyV infezione. L’approccio descritto di pesce può anche essere adattato per rilevare i bassi livelli di DNA virale presente nella pelle umana infetta.

Introduction

Polyomavirus delle cellule di Merkel (MCPyV) è un piccolo, double-stranded virus a DNA che è stato associato con un tumore di pelle raro ma aggressivo, Merkel cell carcinoma (MCC)1,2. Il tasso di mortalità di MCC, circa il 33%, superiore a quella del melanoma3,4. MCPyV ha un genoma circolare di ~ 5 kb1,5 , diviso in due da una regione regolatrice non codificanti (NCRR) in precoce e tardiva codifica regioni1. Il NCRR contiene l’origine virale della replica (Ori) e promotori di bidirezionale per trascrizione virale6,7. La regione precoce codifica proteine antigene tumore chiamati grande T (LT), piccolo T (sT), 57kT, alternativa LT ORF (ALTO), come pure un autoregulatory miRNA1,8,9,10. La regione tarda codifica per le proteine del capside VP1 e VP211,12,13. LT e sT sono le proteine di MCPyV meglio studiate e sono stati indicati per sostenere la replicazione del DNA virale e tumorigenesis indotto MCPyV5. Integrazione clonale di MCPyV DNA nel genoma ospite, che è stato osservato in fino a 80% di MCCs, è probabilmente un fattore causale per tumore virus-positivo sviluppo14,15.

L’incidenza di MCC è triplicato sopra i venti anni ultimi16. MCPyV l’infezione asintomatica è diffuso nella popolazione generale17,18,19. Con il crescente numero di diagnosi MCC e l’alta prevalenza dell’infezione di MCPyV, c’è la necessità di migliorare la nostra comprensione del virus e la sua potenziale oncogeno. Tuttavia, molti aspetti della biologia di MCPyV e meccanismi oncogenici rimangono capita male20. Questo è in gran parte perché MCPyV replica scarsamente cellulari stabilizzate linee11,12,21,22,23 e, fino a poco tempo, in grado di supportare MCPyV le cellule della pelle infezione non era stati individuati22. Gli studi meccanicistici per investigare completamente MCPyV e la sua interazione con cellule dell’ospite sono stati ostacolati dalla mancanza di sistema di coltura cellulare per propagare il virus5.

Abbiamo scoperto che fibroblasti cutanei umani primari (HDFs) isolato da infezione di prepuzio umano neonatale supporto robusto MCPyV entrambi in vitro ed ex vivo24. Da questo studio, abbiamo stabilito il primo modello di infezione di coltura cellulare per MCPyV24. Sulla base di questo sistema di modello, abbiamo mostrato che l’induzione di geni metalloproteasi (MMP) matrice di WNT/β-catenin signaling pathway e altri fattori di crescita stimola l’infezione MCPyV. Inoltre, abbiamo trovato che la nuova antagonista MEK approvato dalla FDA inibisce efficacemente l’infezione MCPyV5,25. Da questi studi, abbiamo anche stabilito una serie di protocolli per l’isolamento di fibroblasti cutanei umani24,25, preparando MCPyV virioni11,12, eseguendo MCPyV infezione su fibroblasti cutanei umani 24 , rilevazione MCPyV proteine di IF colorazione26e 25 . Inoltre, ci siamo adattati in situ del DNA ibridazione reazione a catena (HCR) tecnologia27 per sviluppare una tecnica altamente sensibile di pesce (pesce HCR-DNA) per la rilevazione del DNA di MCPyV in cellule epiteliali umane infettate. Questi nuovi metodi sarà utili per lo studio del ciclo infettivo di MCPyV, come pure la risposta cellulare all’infezione MCPyV. Le cellule di serbatoio ospite naturale che mantengono l’infezione MCPyV e le cellule che danno origine a tumori MCC rimangono sconosciute. Le tecniche che descriviamo in questo manoscritto potrebbero essere applicate per esaminare vari tipi di cellule umane di identificare sia le cellule del serbatoio e l’origine dei tumori MCC. I nostri metodi consolidati, come il pesce HCR-DNA, potrebbero essere impiegati anche nel rilevamento di altri virus oncogeni a DNA e la caratterizzazione delle interazioni delle cellule ospite.

Protocol

Prepuzi neonatale umane sono stati ottenuti da Penn pelle malattia Research Center. Fibroblasti umani adulti sono stati ottenuti da pelle normale scartata dopo la chirurgia. Tutti i protocolli sono stati approvati dall’Università della Pennsylvania Institutional Review Board. 1. isolamento dei fibroblasti cutanei umani Utilizzare un paio di forbici per tagliare il grasso e del tessuto sottocutaneo dal prepuzio umano neonatale e tagliare il campione di pelle in metà o in quarti.</li…

Representative Results

Il protocollo descritto in questo manoscritto ha permesso l’isolamento di una popolazione quasi omogenea di HDFs (Figura 1). Come dimostrato dalla macchiatura immunofluorescente, quasi il 100% di cellule cutanee umane isolate utilizzando le condizioni descritte in questo protocollo sono state positivamente macchiato per gli indicatori dei fibroblasti cutanei, il vimentin e collagene sono24, ma la negazione per l’essere umano marcatore …

Discussion

I metodi descritti sopra, compreso isolamento dei fibroblasti cutanei dal tessuto di pelle umana, la preparazione dei virions MCPyV ricombinante, infezione di cellule coltivate, macchiatura immunofluorescente e un metodo sensibile di pesce adattato dalla tecnologia HCR, che dovrebbe consentire ai ricercatori di analizzare MCPyV infezione27. Una delle fasi più critiche al raggiungimento MCPyV infezione in vitro è la produzione di preparazioni di alto-titolo virione. Utilizzando il protocollo per …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori vorrei ringraziare il Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) e Dr. M. Celeste Simon (University of Pennsylvania) per la fornitura di reagenti e supporto tecnico. Ringraziamo anche i membri dei nostri laboratori di discussione utile. Questo lavoro è stato supportato dalle borse di studio del National Institutes of Health (NIH) (R01CA187718, R01CA148768 e R01CA142723), il NCI Cancer Center Support Grant (NCI P30 CA016520) e il premio di Penn CFAR (P30 AI 045008).

Materials

Fetal calf serum HyClone SH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X Thermo Fisher Scientific 11140050
GLUTAMAX I, 100X Thermo Fisher Scientific 35050061 L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190136
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300-054
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CF R&D systems 236-EG-200 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Cayman Chemical 13122 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Sigma SML1046 Store at -80 degree celsius
Collagenase type IV Thermo Fisher Scientific 17104019
Dispase II Roche 4942078001
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-062 Protect from light
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific A11032 Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11034 Protect from light
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556 Protect from light
Paraformaldehyde Sigma P6148
anti-MCPyV LT (CM2B4) Santa Cruz sc-136172 Lot # B2717
MCV VP1 rabbit Rabbit polyclonal serum #10965 https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
Hygromycin Roche 10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant Corning 354060 Store at -80 degree celsius
Benzonase Nuclease Sigma E8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase EPICENTRE E3101K
Probe hybridization buffer Molecular technologies
Probe wash buffer Molecular technologies
Amplification buffer Molecular technologies
Alexa 594-labeled hairpins Molecular technologies B4 Protect from light
Triton X-100 Sigma X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Thermo Fisher Scientific P7581
BamHI-HF NEB R3136
Buffer PB Qiagen 19066
blue miniprep spin column Qiagen 27104
50mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352070
T4 ligase NEB M0202T
MagicMark XP Thermo Fisher Scientific LC5602

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Cite This Article
Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection. J. Vis. Exp. (144), e58950, doi:10.3791/58950 (2019).

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