メルケル細胞ポリオーマ ウイルス感染と検出
Summary
ここでは、MCPyV とプライマリひと皮膚繊維芽細胞に感染するプロトコルを提案します。プロトコルには、in situ ハイブリダイゼーションの真皮線維芽細胞の単離、MCPyV ウイルス粒子やウイルス感染、免疫蛍光染色、蛍光の準備が含まれています。このプロトコルは、MCPyV によって MCPyV ホストの相互作用の特性や他の細胞型の感染の発見に拡張できます。
Abstract
メルケル細胞ポリオーマ ウイルス (MCPyV) の感染は、メルケル細胞腫 (MCC)、皮膚癌の非常に積極的なフォームにつながります。MCPyV 分子生物学と発癌のメカニズムを完全に調査する機械論的研究は、適切な細胞培養モデルの欠如によって妨げられています。ここでは、一連の実行および主要な人間の皮膚細胞の MCPyV 感染症を検出するためのプロトコルについて述べる。プロトコル (IF) な免疫蛍光染色、原の DNA ハイブリダイゼーション連鎖反応 (HCR)、非常に敏感である組換え MCPyV 粒子の作製とウイルス感染症の検出ひと真皮線維芽細胞の隔離を記述します。現場の交配 (魚) のアプローチで蛍光します。本プロトコルは、他のセルタイプまたはサポート MCPyV 感染細胞を識別するために興味がある研究者によって合わせることができます。説明魚アプローチは、また、ウイルス Dna 感染したひと皮膚に存在の低レベルを検出するため適応でした。
Introduction
メルケル細胞ポリオーマ ウイルス (MCPyV) は、稀だが攻撃的な皮膚癌、メルケル細胞癌 (MCC)1,2に関連付けられている小さな、二本鎖 DNA ウイルスです。クライアントは、約 33% の死亡率は、悪性黒色腫3,4を超えています。MCPyV は、初期および後期地域1のコーディングに非コーディングの規制地域 (傘下) によって二等分される 〜 5 kb1,5の円形ゲノム。傘下には、ウイルスの起源レプリケーション (Ori) とウイルスの転写6、7のための双方向性プロモーターが含まれています。初期の地域型 miRNA1,8,9,10と同様、大きい T (LT)、小さい T (sT)、57kT、代替 LT ORF (アルト) と呼ばれる腫瘍抗原タンパク質をエンコードします。後半の地域は、カプシド タンパク質 VP1 と VP211,12,13をエンコードします。LT、sT 最高研究 MCPyV 蛋白質は、ウイルスの DNA 複製と MCPyV 誘発消化管腫瘍5をサポートするために示されています。MCCs の 80% までで観察されている、ホストのゲノムに MCPyV DNA のクローンの統合可能性がウイルス陽性腫瘍開発14,15の原因因子です。
MCC の発生率は、過去 20 年16に三倍になった。MCPyV 感染の無症候性も一般的な人口17,18,19の普及です。クライアント診断数の増加と MCPyV 感染の高い有病率、ウィルスとその発癌性潜在性の私達の理解を改善する必要があります。ただし、MCPyV 生物学および発癌のメカニズムの多くの側面は、ほとんど理解20を保ちます。これは主な理由は MCPyV は悪い細胞ライン11,12,21,22,23複製し、最近まで、皮膚細胞の MCPyV をサポート感染症では、発見された22はされていませんでした。完全に MCPyV と宿主細胞との相互作用を調査する機構の研究は、ウイルス5を伝播するための細胞培養系の欠如によって妨げられています。
プライマリひと真皮線維芽細胞 (HDFs) が両方生体外で人間の新生児包皮サポート堅牢な MCPyV 感染に由来がわかりましたと前のヴィヴォ24。本研究からは、MCPyV24の最初の細胞培養感染モデルを確立しました。このモデル システム上に構築された、WNT/β-カテニン シグナル伝達経路と他の成長因子によるマトリックス マトリックスメタロプロテアーゼ (MMP) 遺伝子の誘導が MCPyV 感染症を刺激することを示した.さらに、FDA 承認 MEK 拮抗薬 trametinib が MCPyV 感染症5,25を効果的に阻害することがわかった。これらの研究から我々 も策定してひと真皮線維芽細胞24,25を分離するためのプロトコルの準備 MCPyV 粒子11,12、ひと皮膚線維芽細胞の MCPyV 感染を実行します。24,25と場合染色26検出 MCPyV 蛋白質。さらに、我々 は、その場で DNA ハイブリダイゼーション連鎖反応 (HCR) 技術27感染したヒトの皮膚細胞の MCPyV DNA を検出する高感度の魚の技術 (HCR DNA 魚) を開発する適応。これらの新しいメソッドは MCPyV 感染に対する細胞の応答と同様、MCPyV の感染サイクルの勉強の役に立つでしょう。MCPyV 感染を維持する自然なホスト貯留層細胞と MCC 腫瘍を生じさせる細胞は不明のまま。本稿で述べる技術は、貯留層細胞を識別するためにひと細胞の様々 な種類と MCC 腫瘍の起源を調べるに適用でした。HCR DNA 魚など、方法を確立は、他の DNA の腫瘍ウイルスの検出、ホスト細胞相互作用の評価にも用いることが。
Protocol
Representative Results
Discussion
人間の皮膚組織から真皮線維芽細胞の単離、遺伝子組換え MCPyV 粒子の作製、培養細胞、免疫蛍光染色、HCR 技術から適応魚法の感染など、上記の方法をMCPyV 感染症27を分析する研究者を有効にする必要があります。MCPyV 感染症体外を達成するために最も重要な手順の 1 つは高力価ウイルス粒子製剤の生産です。ここで説明した組換え MCPyV ウイルス粒子の準備のためのプロト?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、試薬およびテクニカル サポートを提供するため、博士 Meenhard Herlyn (ウィスター研究所) とサイモン ・ m ・ セレステ (ペンシルベニア大学) を感謝したいです。私たちはまた役に立つ議論のため私たちの研究所のメンバーに感謝します。この作品は、国立衛生研究所 (NIH) 助成金 (R01CA187718、R01CA148768、R01CA142723)、NCI 癌センター助成金 (NCI P30 CA016520)、およびペン CFAR 賞 (P30 AI 045008) によって支えられました。
Materials
| Fetal calf serum | HyClone | SH30071.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| GLUTAMAX I, 100X | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-Glutamine |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG-200 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Sigma | SML1046 | Store at -80 degree celsius |
| Collagenase type IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | Protect from light |
| DMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A11032 | Protect from light |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Protect from light |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | Protect from light |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| anti-MCPyV LT (CM2B4) | Santa Cruz | sc-136172 | Lot # B2717 |
| MCV VP1 rabbit | Rabbit polyclonal serum #10965 | https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant | Corning | 354060 | Store at -80 degree celsius |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 | |
| Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase | EPICENTRE | E3101K | |
| Probe hybridization buffer | Molecular technologies | ||
| Probe wash buffer | Molecular technologies | ||
| Amplification buffer | Molecular technologies | ||
| Alexa 594-labeled hairpins | Molecular technologies | B4 | Protect from light |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Thermo Fisher Scientific | P7581 | |
| BamHI-HF | NEB | R3136 | |
| Buffer PB | Qiagen | 19066 | |
| blue miniprep spin column | Qiagen | 27104 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| T4 ligase | NEB | M0202T | |
| MagicMark XP | Thermo Fisher Scientific | LC5602 |
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