JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
면역학 및 감염병학

Меркель клеток ПОЛИОМАВИРУСОВ инфекции и обнаружения

Published: February 07, 2019
doi:
10.3791/58950
, , ,
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology,National Cancer Institute

Summary

Здесь мы представляем протокол заразить первичного человека фибробластов дермы с MCPyV. Протокол включает изоляции фибробластов дермы, подготовка вирионы MCPyV, вирусной инфекции, иммунофлюоресценции окрашивание и флуоресценции в гибридизации situ. Этот протокол может быть продлено характеризующих MCPyV хост взаимодействий и открывать другие типы клеток заражаемые по MCPyV.

Abstract

Меркель клеток ПОЛИОМАВИРУСОВ (MCPyV) инфекция может приводить к Меркель карцинома (MCC), высоко агрессивной формой рака кожи. Механистический исследования полностью MCPyV молекулярной биологии и расследовать онкогенных механизмы сдерживаются отсутствием адекватных клетки культуры моделей. Здесь мы описывают набор протоколов для выполнения и обнаружения инфекции MCPyV клеток первичной человеческой кожи. Протоколы описывают изоляции фибробластов дермы, подготовка рекомбинантных MCPyV вирионов и обнаружения заражения вирусом, immunofluorescent окрашивание (КРП) и на месте ДНК гибридизации цепной реакции (HCR), которая очень чувствительна флуоресценции в situ гибридизация (рыба) подход. Протоколы здесь могут быть адаптированы заинтересованными исследователями для определения других типов клеток и клеточных линий, которые поддерживают MCPyV инфекции. Описанный подход рыбы также могут быть адаптированы для обнаружения низкий уровень вирусной ДНК в зараженных кожи человека.

Introduction

Меркель клеток ПОЛИОМАВИРУСОВ (MCPyV) является небольшой, двуцепочечной ДНК вируса, которая была связана с редким, но агрессивных кожи рак, Меркель клеток карциномы (MCC)1,2. MCC, около 33%, показатель смертности превышает меланомы3,4. MCPyV имеет циркулярный геном ~ 5 КБ1,5 пополам некодирующих регулирования региона (NCRR) в ранний и поздний кодирования регионах1. NCRR содержит вирусного происхождения репликации (ОРИ) и двунаправленный промоутеров для вирусных транскрипции6,7. Начале региона кодирует опухолевого антигена белки, называемые большой T (LT), небольшой T (ул), 57kT, альтернативные ORF LT (альт), а также ауторегуляторных Мирна1,8,9,10. Конце региона кодирует белки VP1 капсида и VP211,12,13. LT и sT являются наиболее изученных MCPyV белков и продемонстрировали для поддержки репликации вирусных ДНК и MCPyV индуцированной tumorigenesis5. Клоновых интеграция MCPyV ДНК в геном хост, который наблюдается в до 80% КЦС, скорее всего является причинным фактором для развития вируса позитивные опухоли14,15.

Распространенность MCC утроилось за последние двадцать лет16. Бессимптомной инфекции MCPyV также широко распространена в общей численности населения17,18,19. С увеличением числа диагнозов MCC и высокая распространенность инфекции MCPyV существует необходимость улучшить наше понимание вируса и его онкогенные потенциал. Однако многие аспекты MCPyV биологии и онкогенных механизмы остаются плохо понимали20. Это главным образом потому, что MCPyV реплицирует плохо в установленных клеток линии11,12,21,,2223 и, до недавнего времени, поддерживающие MCPyV клеток кожи инфекция не обнаружили22. Механистический исследования полностью расследовать MCPyV и его взаимодействие с клетки хозяина сдерживаются отсутствием системы культуры клеток для размножения вируса5.

Мы обнаружили, что первичный фибробластов дермы (HDFs) изолированы от новорожденных человека плоть поддержки надежных MCPyV инфекции как в пробирке и ex vivo24. Из этого исследования мы создали первый модель инфекции культуры клеток для MCPyV24. Опираясь на эту модель системы, мы показали, что индукция матрицы металлопротеиназы (СПП) генов WNT/β-катенина сигнальный путь и другие факторы роста стимулирует MCPyV инфекции. Кроме того мы обнаружили, что FDA утвержденных MEK антагонист trametinib эффективно подавляет MCPyV инфекции5,25. Из этих исследований мы также создали набор протоколов для изоляции фибробластов дермы24,25, подготовка MCPyV вирионы11,12, выполняя MCPyV инфекции на фибробластов дермы 24 , 25 и детектирования MCPyV белков, если окрашивание26. Кроме того мы адаптированы на месте ДНК гибридизации цепной реакции (HCR) технология27 для разработки высокочувствительных рыбы техника (HCR-ДНК рыбы) для обнаружения MCPyV ДНК в клетках, инфицированных кожи человека. Эти новые методы будет полезным для изучения инфекционных цикл MCPyV, а также клеточного ответа на инфекцию MCPyV. Клетки водохранилище природного хозяина, которые поддерживают MCPyV инфекции и клетки, которые порождают MCC опухоли остаются неизвестными. Изучить различные типы клеток человека для выявления водохранилище клетки и происхождения опухоли MCC могут применяться методы, которые мы опишем в этой рукописи. Наши установленные методы, такие как HCR-ДНК рыбы, также могут быть использованы в обнаружении других ДНК вирусов опухоли и характеристика принимающей ячейки взаимодействий.

Protocol

Человека новорожденных иммунохимические были получены от Пенн кожи болезни научно-исследовательский центр. Взрослый фибробластов были получены из выброшенных нормальной кожи после операции. Все протоколы были одобрены в университете Пенсильвании институциональных Наблюдательный ?…

Representative Results

Протокол, описанный в этой рукописи позволили изоляции почти однородного населения HDFs (рис. 1). Как показали immunofluorescent окрашивание, почти 100% кожных клеток человека изолированы с помощью условий, описанных в настоящем протоколе были положительно витражи…

Discussion

Методы, описанные выше, включая изоляции фибробластов дермы из ткани кожи человека, подготовка рекомбинантных MCPyV вирионов, заражения культивируемых клеток, immunofluorescent окрашивание и чувствительным методом рыбы адаптирован из HCR технологии, которая следует включить исследователей для а…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Meenhard Херлин (Wistar институт) и д-р м. Селеста Симон (Университет штата Пенсильвания) для предоставления реагентов и технической поддержки. Мы также благодарим членов нашей лаборатории для полезной дискуссии. Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения (НИЗ) гранты (R01CA187718, R01CA148768 и R01CA142723), NCI рака центр поддержки Грант (NCI Р30 CA016520) и Пенн CFAR премии (P30 AI 045008).

Materials

Fetal calf serum HyClone SH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X Thermo Fisher Scientific 11140050
GLUTAMAX I, 100X Thermo Fisher Scientific 35050061 L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190136
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300-054
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CF R&D systems 236-EG-200 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Cayman Chemical 13122 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Sigma SML1046 Store at -80 degree celsius
Collagenase type IV Thermo Fisher Scientific 17104019
Dispase II Roche 4942078001
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-062 Protect from light
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific A11032 Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11034 Protect from light
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556 Protect from light
Paraformaldehyde Sigma P6148
anti-MCPyV LT (CM2B4) Santa Cruz sc-136172 Lot # B2717
MCV VP1 rabbit Rabbit polyclonal serum #10965 https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
Hygromycin Roche 10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant Corning 354060 Store at -80 degree celsius
Benzonase Nuclease Sigma E8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase EPICENTRE E3101K
Probe hybridization buffer Molecular technologies
Probe wash buffer Molecular technologies
Amplification buffer Molecular technologies
Alexa 594-labeled hairpins Molecular technologies B4 Protect from light
Triton X-100 Sigma X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Thermo Fisher Scientific P7581
BamHI-HF NEB R3136
Buffer PB Qiagen 19066
blue miniprep spin column Qiagen 27104
50mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352070
T4 ligase NEB M0202T
MagicMark XP Thermo Fisher Scientific LC5602
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gjoerup, O., Chang, Y., Vande Woude, G., Klein, G. . Advances in Cancer Research. 106, 1-51 (2010).
  2. Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
  3. Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
  4. Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
  5. Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
  6. Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
  7. Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
  8. Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
  9. Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
  10. Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
  11. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
  12. Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
  13. Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
  14. Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
  15. Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
  16. Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
  17. Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
  18. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
  19. Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
  20. Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
  21. Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
  22. Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
  23. Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
  24. Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
  25. Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
  26. Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
  27. Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
  28. Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
  29. . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018)
  30. . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018)
  31. . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018)

Tags

Keywords: Merkel Cell PolyomavirusMCPyVCell Culture ModelDermal FibroblastsVirus IsolationImmunofluorescent StainingFluorescent In Situ HybridizationInfectious CycleHost Cell Interactions293TT28 CellsTransfectionST ExpressionLT Expression
check_url/kr/58950?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection. J. Vis. Exp. (144), e58950, doi:10.3791/58950 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image