Merkel Cell Polyomavirus infektion och upptäckt
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att infektera primära mänskliga dermal fibroblast med MCPyV. Protokollet omfattar isolering av dermal fibroblaster, utarbetande av MCPyV virioner, virusinfektion, immunofluorescens färgning och fluorescens in situ hybridisering. Detta protokoll kan förlängas karaktärisera MCPyV-host interaktioner och upptäcka andra celltyper som infectable av MCPyV.
Abstract
Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infektion kan leda till Merkelcellskarcinom (MCC), en mycket aggressiv form av hudcancer. Mekanistiska studier att fullt ut undersöka MCPyV molekylärbiologi och onkogena mekanismer har hämmats av brist på tillräcklig cell kultur modeller. Här, beskriver vi en uppsättning protokoll för att utföra och att upptäcka MCPyV infektion i primära mänskliga hudceller. Protokollen beskriva isolering av mänskliga dermal fibroblaster, beredning av rekombinant MCPyV virioner och upptäckt av virusinfektion av både Immunofluorescerande (om) färgning och jordbaserad DNA-hybridisering kedjereaktion (HCR), som är en mycket känslig fluorescens i situ hybridisering (FISH) tillvägagångssätt. Protokoll som häri kan anpassas av intresserade forskare att identifiera andra celltyper eller cellinjer som stöder MCPyV infektion. Metoden beskrivs fisk kan också anpassas för att upptäcka låga nivåer av viral DNAs närvarande i den infektera mänskliga huden.
Introduction
Merkel cell polyomavirus (MCPyV) är en liten, dubbelsträngat DNA-virus som har associerats med en sällsynt, men aggressiv hudcancer, Merkel cell carcinoma (MCC)1,2. Dödligheten bland MCC, omkring 33%, överträffar av melanom3,4. MCPyV har en cirkulär genomet ~ 5 kb1,5 genomskärs av en icke-kodande regulatoriska region (NCRR) in i tidig och sen kodande regioner1. NCRR innehåller viral ursprung replikering (Ori) och dubbelriktad initiativtagare för viral transkription6,7. Tidiga regionen kodar tumör antigen proteiner som kallas stora T (LT), liten T (sT), 57kT, alternativa LT ORF (ALTO), samt en autoregulatory miRNA1,8,9,10. Sena regionen kodar den kapsid proteiner VP1 och VP211,12,13. LT och sT är de bäst studerade MCPyV proteinerna och har visat sig stödja den virala DNA-replikation och MCPyV-inducerad tumourigenesis5. Klonal integrering av MCPyV DNA i värd genomet, vilket har observerats i upp till 80% av MCCs, är sannolikt en kausal faktor för virus-positiv tumör utveckling14,15.
Incidensen av MCC har tredubblats under de senaste tjugo år16. Asymtomatisk MCPyV infektion är också utbredd i befolkningen17,18,19. Med det ökande antalet MCC diagnoser och den höga prevalensen av MCPyV infektion finns det ett behov att förbättra vår förståelse av viruset och dess onkogen potential. Många aspekter av MCPyV biologi och onkogena mekanismer är dock dåligt förstådd20. Detta beror till stor del MCPyV replikerar dåligt i etablerade cell linjer11,12,21,22,23 och, tills nyligen, hudceller kan stödja MCPyV infektionen hade inte upptäckt22. Mekanistiska studier att fullt ut undersöka MCPyV och dess samspel med värdceller har hämmats av brist på cellodlingssystem för att sprida virus5.
Vi upptäckte att primära mänskliga dermal fibroblaster (HDFs) isolerade från neonatal mänskliga förhud stöd robust MCPyV infektion både in vitro- och ex vivo24. Från denna studie etablerade vi den första cell kultur infektion modellen för MCPyV24. Bygga på detta modellsystem, visade vi att induktion av matrix metalloproteinas (MMP) gener av den WNT/β-catenin signalering utbildningsavsnitt och andra tillväxtfaktorer stimulerar MCPyV infektion. Vi hittade dessutom att FDA-godkända MEK antagonist trametinib effektivt hämmar MCPyV infektion5,25. Från dessa studier har etablerat vi också en uppsättning protokoll för att isolera mänskliga dermal fibroblaster24,25, förbereda MCPyV virioner11,12, utför MCPyV infektion på mänskliga dermal fibroblaster 24 , 25 och upptäcka MCPyV proteiner av om färgning26. Dessutom anpassat vi jordbaserad DNA hybridisering kedjereaktion (HCR) teknik27 för att utveckla en känslig fisk teknik (HCR-DNA fisk) för att upptäcka MCPyV DNA i infekterade mänskliga hudceller. Dessa nya metoder kommer att vara användbart för att studera den smittsamma cykeln av MCPyV as well as den cellulära svaren på MCPyV infektion. De naturliga reservoaren värdceller som upprätthåller MCPyV infektion och de celler som ger upphov till MCC tumörer förblir okänd. De tekniker som vi beskriver i detta manuskript skulle kunna tillämpas för att undersöka olika typer av mänskliga celler att identifiera både reservoar cellerna och ursprung av MCC tumörer. Våra etablerade metoder, såsom HCR-DNA fisk, kunde också vara anställd i upptäckt av andra DNA tumörvirus och karakterisering av värd-cell interaktioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
De metoder som beskrivs ovan, inklusive isolering av dermal fibroblaster från mänsklig hudvävnad, beredning av rekombinant MCPyV virioner, infektion i odlade celler, Immunofluorescerande färgning och en känslig fisk metod anpassad från HCR-teknik, som bör göra det möjligt för forskare att analysera MCPyV infektion27. En av de viktigaste stegen till att uppnå MCPyV infektion in vitro-är produktionen av hög-titer virion preparat. Använder protokollet för beredning av rekombinant MCPyV…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr Meenhard Herlyn (Wistar Institute) och Dr. M. Celeste Simon (University of Pennsylvania) för att tillhandahålla reagens och teknisk support. Vi tackar också ledamöterna i våra laboratorier för bra diskussion. Detta arbete stöds av National Institutes of Health (NIH) bidragen (R01CA187718, R01CA148768 och R01CA142723), NCI Cancer Center stöd beviljande (NCI P30 CA016520) och Penn CFAR award (P30 AI 045008).
Materials
| Fetal calf serum | HyClone | SH30071.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| GLUTAMAX I, 100X | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-Glutamine |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG-200 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Sigma | SML1046 | Store at -80 degree celsius |
| Collagenase type IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | Protect from light |
| DMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A11032 | Protect from light |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Protect from light |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | Protect from light |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| anti-MCPyV LT (CM2B4) | Santa Cruz | sc-136172 | Lot # B2717 |
| MCV VP1 rabbit | Rabbit polyclonal serum #10965 | https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant | Corning | 354060 | Store at -80 degree celsius |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 | |
| Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase | EPICENTRE | E3101K | |
| Probe hybridization buffer | Molecular technologies | ||
| Probe wash buffer | Molecular technologies | ||
| Amplification buffer | Molecular technologies | ||
| Alexa 594-labeled hairpins | Molecular technologies | B4 | Protect from light |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Thermo Fisher Scientific | P7581 | |
| BamHI-HF | NEB | R3136 | |
| Buffer PB | Qiagen | 19066 | |
| blue miniprep spin column | Qiagen | 27104 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| T4 ligase | NEB | M0202T | |
| MagicMark XP | Thermo Fisher Scientific | LC5602 |
References
- Gjoerup, O., Chang, Y., Vande Woude, G., Klein, G. . Advances in Cancer Research. 106, 1-51 (2010).
- Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
- Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
- Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
- Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
- Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
- Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
- Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
- Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
- Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
- Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
- Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
- Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
- Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
- Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
- Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
- Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
- Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
- Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
- Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
- Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
- Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
- Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
- Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
- Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
- Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
- Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
- Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
- . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018)
- . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018)
- . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018)
