放射性脉冲追逐对活细胞蛋白质折叠、迁移和降解的分析
Summary
在这里, 我们描述了一种一般脉冲追逐方法的协议, 该方法允许在活细胞中对蛋白质的折叠、迁移和降解进行动力学分析。
Abstract
放射性脉冲追逐标记是研究活细胞中目标蛋白的构象成熟、向其功能细胞定位的迁移以及目标蛋白降解的有力工具。通过使用短 (脉冲) 无线电标记时间 (lt;30 分钟) 和严格控制的追逐时间, 可以只标记总蛋白质池的一小部分, 并跟随其折叠。当与非还原性 sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sds-page) 和免疫沉淀与 (符合特异性) 抗体结合, 可以非常详细地检查折叠过程。该系统已被用来分析蛋白质的折叠, 其特性有巨大的差异, 如可溶性蛋白质、单通和多通道跨膜蛋白、重 n 和 o-糖基化蛋白以及具有和不具有广泛二硫醚的蛋白质粘 接。脉冲追逐方法是一系列附加特征的动力学研究的基础, 包括共和后修饰、寡聚和聚合, 基本上允许分析从出生到死亡的蛋白质。通过提供更多的时间分辨率和生理信息, 对蛋白质折叠的脉冲追逐研究与其他生物生化和生物物理方法是相辅相成的。本文中描述的方法很容易适应于研究几乎任何蛋白质的折叠, 可以在哺乳动物或昆虫细胞系统中表达。
Introduction
即使是相对简单的蛋白质的折叠也涉及许多不同的折叠酶、分子伴侣和共价修饰1。考虑到所涉及的大量不同成分,在体外完全重组这些过程实际上是不可能的。因此, 研究活细胞中的蛋白质折叠是非常可取的。放射性脉冲追逐技术被证明是研究蛋白质在自然环境中的合成、折叠、迁移和降解的有力工具。
蛋白质在带有35s 标记的蛋氨酸标记的短脉冲中的代谢标记, 然后在没有放射性标签的情况下进行追逐, 从而可以在更广泛的细胞环境中对新合成的蛋白质群进行特定的跟踪。然后, 目标蛋白可以通过免疫沉淀分离, 并通过sds-page 或其他技术进行分析。对于许多蛋白质来说, 它们穿过细胞的旅程是由 sds-page 凝胶上可见的修饰所标记的。例如, 糖基化蛋白从内质网 (er) 传输到 golgi 复合物时, 往往会对 n-连锁的糖类进行修改, 或添加 o-连锁的糖基 2,3。这些修饰会导致表观分子质量的大幅增加, 这可以从 sds-page 中的移动性变化中看出。成熟也可以表现为蛋白溶解裂解, 如信号肽裂解或去除亲肽, 导致表观分子质量的变化, 可以很容易地遵循 sds-page 凝胶4。与环己酰亚胺酶等可比技术相比, 放射性具有相当大的优势, 在这种技术中, 可以防止新的蛋白质合成, 因为较长的处理方法对细胞有毒, 并且不将大多数较旧的稳态蛋白质排除在分析, 因为一些蛋白质有半生的日子。蛋白质在非还原和还原条件下的比较可以分析二硫键的形成,这是许多分泌蛋白 4,5,6折叠的一个重要步骤,7。
在这里, 我们描述了一个一般的方法来分析蛋白质折叠和运输在完整的细胞, 使用放射性脉冲追逐的方法。虽然我们的目标是提供尽可能详细的方法, 但该协议的适应性潜力几乎是无限的, 可以优化研究每个读者的特定蛋白质。
提供了两种可供选择的脉冲追逐协议, 一种用于粘附细胞 (此处介绍的协议的步骤 1.1) 和用于悬浮细胞的方案 (此处介绍的协议的步骤 1.2)。这里提供的条件足以想象用中高表达水平表达的蛋白质。如果读者使用的是表达不良的蛋白质或各种治疗后条件, 如多重免疫沉淀, 则有必要适当增加菜品大小或细胞数量。
对于悬架脉冲追逐, 在每个时间点采集的追逐样本都是从一管细胞中提取的。在脉冲被省去之后洗涤步;相反, 进一步加入35s是通过稀释高过量的未标记蛋氨酸和半胱氨酸。
所提出的协议使用放射性35s 标记半胱氨酸和蛋氨酸来跟踪细胞蛋白折叠过程。所有使用放射性试剂的操作都应使用适当的保护措施, 以尽量减少操作人员和环境受到放射性辐射的任何照射, 并在指定的实验室进行。由于脉冲追逐标记技术在短脉冲时间 (& lt;15 分钟) 下效率相对较低, 新合成的蛋白质中加入的放射性起始量不到1%。通过免疫沉淀浓缩目标蛋白后, sds-page 样品中放射性起始量的含量不到0.05%。
虽然35s 蛋氨酸和半胱氨酸标记混合物是稳定的, 一些分解, 产生挥发性放射性化合物, 将发生。为了保护研究人员和仪器, 应采取一些预防措施。研究人员应始终遵守当地的辐射安全规则, 除了实验室外套和 (双手套) 外, 还可以佩戴木炭护理面罩。含有 35s 蛋氨酸和半胱氨酸的股票瓶应始终在烟罩中打开, 或在局部抽吸点下打开。已知的实验室污染点是离心机、移液器、水浴、孵化器和振荡器。通过使用带有木炭过滤器的移液器尖端、正密封微离心管 (见材料表)、水浴中的水族馆木炭海绵、粘在脉冲追逐盘中的木炭滤纸, 减少了对这些地区的污染,在抽吸系统中设置木炭防护装置, 并将含有木炭颗粒的盘子放置在孵化器和储存容器中。
Protocol
Representative Results
Discussion
脉冲追逐方法对于培养科学家对完整细胞中蛋白质折叠的理解至关重要。虽然我们试图提供一种尽可能通用的方法, 但这种方法有可能几乎无限的变化来研究细胞内蛋白质折叠、运输和生命过程中发生的各种过程。
在洗碗中使用粘附细胞进行脉冲追逐时, 必须尽可能多地处理每道菜, 因为在实验中的每个时间点和/或条件都使用单独的菜品。特别是对于短脉冲和追逐时间 (& lt;5 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢过去和现在的布拉克曼实验室的所有成员, 他们进行了富有成果的讨论, 并帮助开发了本文中介绍的方法。该项目得到了欧洲研究理事会在欧洲联盟第七个框架方案 (fp来 2007-2013) 下的资助, 以及荷兰科学研究组织 (nwo) 根据 echo 方案711.012.008 提供的资金。
Materials
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20×25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4˚C |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
References
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