Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi
Summary
Burada tarif biz katlama, taşıma ve yıkımı canlı hücrelerde takip edilecek proteinlerin kinetik analiz sağlar bir genel nabız-chase yöntemi için bir iletişim kuralı.
Abstract
Radyoaktif nabız-chase etiketleme eğitim konformasyon olgunlaşma, taşıma fonksiyonel hücresel konumlarını ve hedef proteinler canlı hücrelerde bozulma için güçlü bir araçtır. Kısa (darbe) radiolabeling kez kullanarak (< 30 dk) ve sıkı kontrol chase kere, toplam protein havuzu yalnızca küçük bir kısmını etiket ve onun katlama izleyin mümkündür. Nonreducing/azaltılması SDS-polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) ve immunoprecipitation (özel biçimi) antikorları ile birleştirildiğinde, süreçleri katlama ayrıntılı olarak incelenebilir. Bu sistem özellikleri çözünür protein, tekli ve çoklu geçiş transmembran proteinler, ağır N ve O glikozile proteinler gibi büyük bir varyasyon ile protein ve protein ve geniş disülfür olmadan Katlama çözümlemek için kullanılan bağ. Nabız-chase yöntemleri co ve ardından değişiklikleri, Oligomerizasyonda ve polimerizasyonu, temelde analiz bir protein doğumdan ölüme izin dahil olmak üzere ek özellikleri bir dizi içine kinetik çalışmalar temelidir. Nabız-chase çalışmalar protein katlanması üzerinde çalışmak için proteinler vitro artan zamansal çözünürlük ve fizyolojik bilgi sağlayarak diğer Biyokimya ve biyofizik yöntemleri ile tamamlayıcı niteliktedir. Bu kağıt içinde açıklandığı gibi yöntemleri kolayca neredeyse memeli ya da böcek-hücre sistemlerinde ifade edilebilir herhangi bir protein katlama çalışmaya adapte.
Introduction
Hatta nispeten basit protein katlama birçok farklı katlama enzim, moleküler chaperones ve kovalent modifikasyon1içerir. Bu işlemler vitro tam bir sulandırma farklı bileşenleri dahil çok sayıda göz önüne alındığında pratik olarak mümkün değildir. Bu nedenle, in vivo, canlı hücrelerde katlama protein çalışmaya son derece arzu edilir. Radyoaktif nabız-chase teknikleri sentezi, katlama, taşıma ve proteinlerin kendi doğal ortamlarında bozulma çalışmak için güçlü bir araç kanıtlamak.
Metabolik 35S etiketli metiyonin/Sistein ile kısa bir darbe sırasında proteinlerin etiketleme, radyoaktif bir etiket yokluğunda bir kovalamaca ardından, daha geniş hücresel ortamında yeni sentezlenmiş protein bir nüfusun belirli izlenmesini sağlar. Sonra hedef proteinler ve üzerinden SDS-sayfası veya diğer tekniklerle analiz izole yolu ile immunoprecipitation olabilir. Çoğu protein için onların yolculuk boyunca hücre SDS-sayfa jel üzerinde görülebilen değişiklikler tarafından işaretlenir. Örneğin, taşıma glikozile proteinlerin endoplazmik retikulum (ER) üzerinden Golgi kompleksi kez glukanlardir N bağlı değişiklikler veya ek O bağlantılı glukanlardir2,3tarafından eşlik ediyor. Bu değişiklikler büyük artışlar SDS-sayfa hareketlilik değişiklikler görülebilir belirgin molekül ağırlığı neden. Olgunlaşma, sinyal peptid bölünme veya pro-peptidler, değişiklikleri kolayca SDS-sayfa jel4üzerinde takip edilmesi belirgin molekül ağırlığı sonuçlanan kaldırılması gibi proteolitik kesim tarafından da işaretlenebilir. Radyoaktivite vardır sikloheksimit çarpma gibi karşılaştırılabilir teknikleri üzerinde önemli avantajlar olarak daha uzun tedaviler hücrelere zehirlidir ve büyük, kararlı durum proteinler çoğunluğu dışlamayın nerede roman protein sentezi, engellenir Analizi, bazı proteinler yarım-gün canlıdır. Proteinler nonreducing her ikisi de altında karşılaştırılması ve koşulları azaltmak sağlar analiz disülfit bağı oluşumu, birçok salgı proteinler4,5,6, katlanır önemli bir adım 7.
Burada biz bir radyoaktif nabız-chase yaklaşım kullanarak protein katlanması ve sağlam olan hücrelerde taşıma analizi için genel bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntemi olarak sağlamak amaçlanmıştır iken mümkün olduğunca ayrıntılı protokol adaptasyon için neredeyse sınırsız bir potansiyele sahiptir ve optimizasyon her okuyucunun spesifik proteinlerin çalışmaya izin verir.
İki alternatif darbe-chase protokol, bir yapışık hücreleri (adım 1.1 burada sunulan Protokolü) ve süspansiyon hücreleri (adım 1.2 burada sunulan Protokolü) için sağlanır. Koşulun sağlanması halinde burada orta-yüksek ifade düzeyleri ile ifade edilen bir protein görselleştirmek yeterli vardır. Eğer okuyucu kötü ifade proteinler veya birden çok immunoprecipitations gibi çeşitli posttreatment koşulları ile çalışma çanak boyutunu artırın veya uygun şekilde sayı hücre gereklidir.
Süspansiyon darbe chase için her zaman noktada alınan chase örnekler tüm hücreleri tek bir tüp alınır. Darbe ihmal sonra yıkama adımları; Bunun yerine, daha fazla 35S birleşmesiyle etiketlenmemiş metionin ve sistein yüksek bir fazlalığı ile seyreltme tarafından engellenir.
Hücresel protein katlanması işlemlerini takip için radyoaktif 35S etiketli sistein ve metionin sunulan iletişim kurallarını kullanır. Radyoaktif reaktifleri ile tüm işlemleri herhangi bir operatör ve radyoaktif Radyasyon ortamına maruz en aza indirmek ve belirlenmiş bir laboratuarda gerçekleştirilen uygun koruyucu önlemleri kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Nabız-chase teknik etiketleme kısa darbe zamanlarda nispeten verimsiz (< 15dk), radyoaktivite başlangıç miktarı % 1'i yeni sentezlenmiş protein dahil daha az. Üzerinden hedef protein immunoprecipitation zenginleştirme sonra radyoaktivite başlangıç miktarı daha az % 0.05 SDS-sayfa için örnek içerir.
35S metionin ve mix etiketleme sistein stabilize rağmen bazı ayrıştırma radyoaktif uçucu bileşikler, verimli, ortaya çıkar. Araştırmacı ve aparatı korumak için bazı önlemler alınmalıdır. Araştırmacı her zaman yerel radyasyon güvenlik kurallarına itaat etmelisin ve maske, önlük ve eldiven (Çift Kişilik) yanı sıra hemşirelik kömür olabilir. Hisse senedi şişeleri 35S metionin ve sistein ile her zaman bir duman başlıklı veya yerel aspirasyon noktası altında açılmalıdır. Bilinen laboratuvar kirlenme Santrifüjler Pipetler, su hamamlar, kuluçka ve shakers noktalardır. Bu alanların kirlenme pipet ipuçlarını kullanarak bir kömür filtre, pozitif-mühür microcentrifuge tüpler ( Tablo malzemelerigörmek), akvaryum kömür sünger nabız-chase yemekleri yapıştırılmış su banyoları, kömür filtre gazetelerde azalır, aspirasyon sistemi ve bulaşık kuluçka ve saklama kapları kömür tahıl içeren yerleşimini kömür muhafız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nabız-chase yöntemleri protein sağlam hücreleri katlama bilim adamlarının anlayış geliştirmek için gerekli olmuştur. Biz mümkün olduğu kadar genel bir yöntem sağlamak teşebbüs ederken, bu yaklaşım katlanır, taşıma ve yaşam proteinlerin hücre içinde sırasında oluşan çeşitli işlemleri incelemek neredeyse sınırsız varyasyonları için potansiyele sahiptir.
Yemekleri yapışık hücreleri kullanarak bir darbe takip gerçekleştirirken, aynı ayrı tabak olarak m?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar geçmiş Braakman Lab, tüm üye teşekkür ve, onların verimli tartışmalar için mevcut ve bu makalede sunulan yöntemleri geliştirmede yardımcı. Bu proje Avrupa Araştırma Konseyi Avrupa Birliği’nin yedinci çerçeve programı (FP7/2007-2013) N ° 235649 altında ve Hollanda organizasyon, bilimsel araştırma (NWO) ECHO programı N ° 711.012.008 altında fon aldı.
Materials
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20×25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4˚C |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
References
- Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
- Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
- Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle. Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).
- Snapp, E. L., et al. Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide. Elife. 6, 26067 (2017).
- Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).
- Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein. Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).
- Land, A., Braakman, I. Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum. Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function. Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).
- Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263 (1), 55-69 (1999).
- Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).
- Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin. Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).
- Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones. Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).
- Hoelen, H., et al. The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain. PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e. Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).
- Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport. Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).
