Isolamento del neutrofilo del sangue periferico umano per interrogare il percorso di LRRK2 Kinase associato al Parkinson valutando Rab10 Phosphorylation
Summary
Le mutazioni nel gene della leucina ricca di parentesi 2 (LRRK2) causano il morbo di Parkinson ereditario. Abbiamo sviluppato un metodo semplice e robusto per valutare il fosfororylazione controllata da LRRK2 di Rab10 nei neutrofili del sangue periferici umani. Questo può aiutare a identificare gli individui con aumento dell’attività del percorso della chinasi LRRK2.
Abstract
La leucina ricca di chinasi 2 (LRRK2) è il gene più frequentemente mutato nella malattia ereditaria del Parkinson (PD) e tutte le mutazioni patogene dell’LRRK2 provocano l’iperattivazione della sua funzione di chinasi. Qui, descriviamo un saggio facile e robusto per quantificare l’attività della via della chinasi LRRK2 nei neutrofili del sangue periferici dell’uomo misurando la fosforolazione controllata da LRRK2 di uno dei suoi substrati fisiologici, Rab10 alla trenolina 73. L’analisi dell’immunoblotting descritta richiede un anticorpo completamente selettivo e fosfospecifico che riconosca l’epitopo Rab10 Thr73 fosforerilato da LRRK2, come l’anticorpo monoclonale del coniglio MJFF-pRab10. Esso utilizza neutrofili del sangue periferici umani, perché il sangue periferico è facilmente accessibile e i neutrofili sono un costituente abbondante e omogeneo. È importante sottolineare che i neutrofili esprimono livelli relativamente elevati di LRRK2 e Rab10. Un potenziale inconveniente dei neutrofili è la loro elevata attività intrinseca di proteasi serina, che richiede l’uso di inibitori della proteasi molto potenti come la diisopropylfluorofosfati (DIFP) organosa. Tuttavia, i neutrofili sono una risorsa preziosa per la ricerca sull’attività del percorso della chinasi LRRK2 in vivo e dovrebbero essere considerati per l’inclusione nelle collezioni di biorepository della PD.
Introduction
I tentativi di rallentare o fermare il morbo di Parkinson (PD) sono finora falliti. La scoperta di mutazioni iperattive nella leucina ricca ripetizione chinasi 2 (LRRK2) che causano e/o aumentano il rischio di PD ha portato allo sviluppo di inibitori della chinasi LRRK21,2,3. Questi sono ora entrati negli studi clinici4. L’esatta funzione di LRRK2 non è chiara, ma un importante progresso è stata l’identificazione di un sottoinsieme di proteine Rab GTPase, tra cui Rab10, come il primo substrati fisiologici in buona fede della chinasi LRRK25,6,7. Le sfide chiave nell’era delle terapie che modificano la malattia sono i marcatori biochimici dello stato di attivazione della chinasi LRRK2 e l’impegno mirato degli inibitori della chinasi LRRK2.
Finora, il principale marcatore farmacocinetico per gli inibitori di LRRK2 in vivo è stato un gruppo di residui di serine costituiti da fosforesti di LRRK2, in particolare serine 935, che diventano deforfatiti in risposta a diversi inibitori di LRRK28,9. Tuttavia, la fosfororylazione serina 935 non è correlata all’attività intrinseca della china lRRK2 cellulare perché non è direttamente fosforilata da LRRK2 ed è ancora fosforilata in lRRK210. L’attività della chinasi LRRK2 si correla bene con l’autofosfororylazione della serina 1292, ma in termini pratici non è una lettura adatta per l’attività endogena della chinaltra LRRK2 mediante l’analisi immunoblot di estratti di cellule intere a causa dell’attuale mancanza di anticorpi affidabili e fosforici per questo sito10,11.
Abbiamo sviluppato un saggio robusto e facile per quantificare l’attività della vaginasi l’LRRK2 nelle cellule del sangue periferiche umane che misura l’fosfororylazione controllata da LRRK2 della sua proteina bersaglio fisiologica Rab10 alla trelina 7311. Il sangue periferico è facilmente accessibile tramite venesezione, che è un basso rischio e una procedura rapida che causa un disagio minimo. Ci concentriamo sui neutrofili del sangue periferici umani perché costituiscono un’abbondante popolazione di cellule bianche (37-80% di tutti i globuli bianchi) e una popolazione omogenea di cellule che esprime livelli relativamente elevati di LRRK2 e Rab1011. Inoltre, i neutrofili del sangue periferico possono essere isolati in modo rapido ed efficiente utilizzando un approccio immunomagnetico negativo. Per garantire che la successiva fosfororylazione Rab10 osservata sia mediata da LRRK2, ogni lotto di neutrofili viene incubato con o senza un potente e selettivo inibitore della chinasi LRRK2 (usiamo e raccomandiamo MLi-2)2,12. Questo è seguito da lisi cellulare in un buffer contenente l’inibitore della proteasi (DIisophofosfato) (DIFP), che è necessario per sopprimere l’attività intrinseca della proteasi serina che è nota per essere ad alta neutrofili13. Per l’analisi finale mediante immunoblotting quantitativa, si consiglia di utilizzare l’anticorpo monoclonale del coniglio MJFF-pRab10 che rileva specificamente il Rab10 Thr73-phosphoepitope e non reagisce incrociatamente con altre proteine Rab fosforolate14. La selettività e la specificità di questo anticorpo è stata convalidata in modelli di sovraespressione di diverse proteine Rab e una linea cellulare Knock-out A549 Rab1014. Così, misuriamo la differenza nella fosforilazione Rab10 nei lismi neutrofili che sono stati trattati con e senza un potente e selettivo inibitore della chinasi LRRK22. In alternativa, i campioni potrebbero anche essere analizzati con altri metodi, come la spettrometria di massa quantitativa.
In conclusione, la fosfororylazione Rab10 controllata da LRRK2 è un marcatore superiore dell’attività della chinasi LRRK2 alla fosforolazione LRRK2 a serine 935 e i neutrofili ematici periferici umani sono una risorsa preziosa per la ricerca della PD in LRRK2. Il nostro protocollo fornisce un saggio robusto e facile per interrogare l’attività del percorso LRRK2 nei neutrofili del sangue periferici e consente la stratificazione biochimica di individui con aumento dell’attività della chinasi LRRK215. È importante sottolineare che tali individui possono beneficiare del futuro trattamento dell’inibitore della chinasi LRRK2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Compelling evidenze cliniche, genetiche e biochimiche indicano un ruolo importante per LRRK2 e in particolare la sua funzione di chinasi nella malattia di Parkinson7. Gli inibitori della chinasi LRRK2 sono stati sviluppati e stanno entrando negli studi clinici2,4,12. Come tale, è necessario sfruttare LRRK2 come biomarcatore per l’impegno con il bersaglio e per la stratificazione del paziente. Il nostro p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i volontari sani che hanno gentilmente donato sangue per il presente studio. Ringraziamo la Michael J. Fox Foundation for Parkinson’s Research (MJFF) e la leadership dello studio Fox BioNet (FBN) per il loro sostegno e input verso il protocollo scritto e il video. Ringraziamo il professor Alexander simprich dell’Università di Vienna in Austria per aver testato il nostro protocollo e la nostra collaborazione. Apprezziamo i contributi di Paul Davies al progetto (direttore generale della PPU MRC). Riconosciamo anche l’eccellente supporto tecnico dei team MRC Protein Phosphorylation and Ubiquilation Unit (PPU), vale a dire Chemical Synthesis (Natalia Shpiro per la sintesi MLi-2), REagents and Services anticorpation (coordinato da Hilary McLauchlan e James Hastie). Ringraziamo Mhairi Towler e Fraser Murdoch di Vivomotion per il loro aiuto nella realizzazione di video e animazioni. Ringraziamo Steve Soave di 81 film per l’assistenza con le modifiche finali. Esther Sammler è sostenuta da una borsa di studio scozzese Senior Clinical Academic e ha ricevuto finanziamenti dal Parkinson nel Regno Unito (K-1706).
Materials
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | MJFF-total Rab10 mouse antibody |
References
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