류신이 풍부한 반복 키나아제 2 유전자(LRRK2)의 돌연변이는 유전성 파킨슨병을 일으킨다. 우리는 인간 말초 혈액 호중구에서 Rab10의 LRRK2 대조 인산화를 평가하기위한 쉽고 강력한 방법을 개발했습니다. 이 증가 LRRK2 키 나 제 통로 활동을 가진 개인을 식별 하는 데 도움이 수 있습니다.
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방법 논문
Rab10 인산화를 평가하여 파킨슨병 관련 LRRK2 키나아제 경로를 심문하기 위한 인간 말초 혈액 호중구 격리
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
류신이 풍부한 반복 키나아제 2(LRRK2)는 유전성 파킨슨병(PD)에서 가장 빈번하게 돌연변이되는 유전자이며 모든 병원성 LRRK2 돌연변이는 키나아제 기능의 과활성화를 초래한다. 여기서, 우리는 그것의 생리적 기질 중 하나인 Rab10을 트레오닌 73에서 LRRK2 대조 포스포릴화를 측정함으로써 인간 말초 혈액 호중구에서 LRRK2 키나아제 통로 활성을 정량화하는 쉽고 강력한 분석방법을 기술한다. 기재된 면역블로팅 분석은 MJFF-pRab10 토끼 모노클로날 항체와 같은 LRRK2에 의해 인산화된 Rab10 Thr73 에피토프를 인식하는 완전 선택적 및 인광특이적 항체를 필요로 한다. 말초 혈액은 쉽게 접근 할 수 있고 호중구는 풍부하고 균일 한 구성 요소이기 때문에 인간의 말초 혈액 호중구를 사용합니다. 중요한 것은, 호중구는 LRRK2와 Rab10 둘 다의 상대적으로 높은 수준을 표현합니다. 호중구의 잠재적인 단점은 그들의 높은 본질적인 세린 프로테아제 활성, 유기 인스포러스 신경 독소 디이소프로필플루오로프포스산염 (DIFP)와 같은 매우 강력한 프로테아제 억제제의 사용을 필요로 하는 리시저 완충제의 일부입니다. 그럼에도 불구하고, 호중구는 생체 내에서 LRRK2 키나아제 통로 활성에 대한 연구를 위한 귀중한 자원이며 PD 생체 저장소 컬렉션에 포함시키는 것으로 고려되어야 한다.
서론
파킨슨 병 (PD)을 늦추거나 멈추려는 시도는 지금까지 실패했습니다. 류신이 풍부한 반복 키나아제 2(LRRK2)에서 의한 과다 활성화 돌연변이의 발견은 PD에 대한 위험을 증가시키고 있거나 증가시키는 LRRK2 키나아제 억제제1,,2,,3의발달로 이어졌다. 이들은 지금 임상 시험4를입력했습니다. LRRK2의 정확한 기능은 불분명하지만, 주요 발전은 LRRK2 키나제,5,6,7의첫 번째 보나 피라제 생리기로서 Rab10을 포함하는 랍 GTPase 단백질의 서브세트의 식별이었다.7 질병 변형 치료제의 시대에 주요 과제는 LRRK2 키나아제 활성화 상태의 생화학적 마커및 LRRK2 키나제 억제제의 표적 결합이다.
지금까지, 생체 내 LRRK2 억제제의 주요 약동학 마커는 LRRK2의 구성적으로 인산화된 세린 잔기의 클러스터였으며, 특히 세린 935는 다양한 LRRK2
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프로토콜
현지 영국 규정에 따르면 인간의 혈액의 모든 조작과 파이펫팅은 카테고리 2 생물학적 안전 캐비닛에서 수행됩니다. 모든 절차는 지역 윤리 검토 위원회에 따라 수행되었으며 모든 참가자는 정보에 입각한 동의를 제공했습니다.
1. 준비
- 인산완식염수(PBS)에 100 mM EDTA를 함유한 EDTA 스톡 솔루션 1의 0.1 mL을 준비합니다.
- PBS에서 1 mM EDTA를 포함하는 EDTA 스톡 솔루션 2의 60 mL을 준비하십시오.
- 50 mM Tris-HCl (pH = 7.5), 1 % (v / v) 트리톤 X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4,50 mM NaF를 포함하는 용해 버퍼를 준비, 10 mMM β-글리세로포스페이트, 5 mMM 파이로포스페이트, 0.27 M 수크로오스, 0.1% (v/v) β-메르카프토에탄올, 1x 프로테아제 억제제 칵테일, 1 μg/mL 마이크로시스틴-LR, 및 0.5 mM 디이소프로필 플루포포스페이트(DP).
참고 : 저자는 정기적으로 EDTA가없는 제품을 사용하지만 EDTA 함유 프로테아제 억제제 칵테일도 작동해야합니다. 용해 완충액은 β-메르카포에탄올, 프로테아제 억제제, 마이크로시스틴-LR 및 DIFP....
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결과
우리의 분석법은 LRRK2 의존적 Rab10 인산화를 판독으로 인간 말초 혈액 호중구에서 PD 관련 LRRK2 키나아제의 활성화를 심문할 수 있게 한다. 호중구는 LRRK2 및 Rab10 단백질 둘 다의 상부를 발현하는 균질하고 풍부한 말초 백혈구 집단이다(그림1). 두 단백질의 높은 사본 수를 가진 나머지 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 중 유일한 그밖 세포 인구는 단핵구입니다, 그러나 이들은 백혈구의 단지 2-12%를 구성합니다. 이는 말초 혈액 호중구가 LRRK2 대조되는 Rab10 인산화를 연구하기에 더 적합한 바이오매트릭스임을 나타낸다.
우리의 절차로 혈액의 10 mL에서 말초 혈액 호중구를 분리할 때, 공여자 당 총 단백질 용해액의 0.5-0.75 mg 사이를 얻어졌습니다(그림 2A),이는 겔 레인 당 단지 10 μg의 면역 blot 분석을 위해 충분합니다. 세.......
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토론
강력한 임상, 유전 및 생화학적 증거는 LRRK2및 특히 파킨슨 병에서 의 키나아제 기능에 대한 중요한 역할을지적7. LRRK2 키나아제 억제제가 개발되어 임상 시험2,,4,,12에진입하고 있다. 이와 같이 LRRK2를 환자 계층화뿐만 아니라 표적 참여에 대한 바이오마커로 활용할 필요성이 있다. 당사의 프로토콜은 인간 말초 혈액 호중구의 균질풀에서 의 생리기질 Rab10의 인산화에 의해 반영된 바와 같이 LRRK2 키나아제 경로 활성화를 분석하기 위한 강력하고 쉬운 분석을 기술한다11,,14. 정량적 면역블롯팅에 의한 분석을 위해, 우리는 고도로 선택적인 인광 특이적 Rab10 항체(MJFF-pRab10 단일클론 항체.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
본 연구를 위해 혈액을 기증해 주신 건강한 자원봉사자들에게 감사드립니다. 마이클 J. 폭스 파킨슨 연구 재단(MJFF)과 폭스 바이오넷 연구 리더십(FBN)이 서면 프로토콜과 비디오에 대한 지원과 의견을 제시해 주신 것에 대해 감사드립니다. 오스트리아 비엔나 대학의 알렉산더 질프리치 교수님이 당사의 프로토콜과 협업을 테스트해 주신 것에 대해 감사드립니다. 우리는 프로젝트 (MRC PPU의 일반 관리자)에 폴 데이비스의 기여를 소중히. 우리는 또한 MRC 단백질 인산화 및 유비퀴틸화 유닛 (PPU) 즉 화학 합성 (MLi-2 합성을위한 나탈리아 슈피로), MRC PPU 시약 및 서비스 항체 정제 팀의 우수한 기술 지원을 인정합니다 (에 의해 조정됨) 힐러리 맥라우클란과 제임스 하스티). 우리는 비디오와 애니메이션을 만드는 데 도움을 비보 모션에서 Mhairi 토울러와 프레이저 머독에게 감사드립니다. 81편의 영화에서 스티브 소아브(Steve Soave)가 최종 편집에 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다. 에스더 샘러는 스코틀랜드 수석 임상 학술 펠로우십의 지원을 받고 있으며 파킨슨 병의 영국 (K-1706)으로부터 자금을 지원받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 피펫 팁 | Sarstedt | 70.762 | 또는 동등한 |
| 1.5 mL 마이크로 튜브 | Sarstedt | 72.690.001 | 또는 동등한 |
| 10 mL 피펫 팁 | 사르슈테트 | 86.1254.025 | 또는 이에 상응하는 |
| 10 &뮤; L 피펫 팁 | Sarstedt | 70.113 | 또는 동급 |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | 또는 동급 |
| 200 μ L 피펫 팁 | Sarstedt | 70.760.002 | 또는 동급 |
| 25 mL 피펫 팁 | Sarstedt | 86.1685.001 | 또는 동급 |
| 50mL 팔콘 튜브 | Cellstar | 227 261 | 또는 동급 |
| BD Vacutainer Hemogard 클로저 플라스틱 K2-EDTA 튜브 | BD | BD 367525 | 또는 동급 |
| Beckman Coulter Allegra X-15R 원심분리기 | Beckman | 또는 1000-1200 x g 범주 2 생물 안전 캐비닛에서 15mL 및 50mL 팔콘 튜브용 수영 버킷 로테이터가 있는 동급 원심분리기 | |
| . | |||
| cOmplete(EDTA-free) 프로테아제 억제제 칵테일 | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | 특별한 주의사항을 사용하여 이소프로판올에 0.5M 스톡 용액을 준비하십시오 |
| 디메틸 설폭사이드 | Sigma | 6250 | |
| 드라이 아이스 또는 액체 질소 | |||
| Dulbecco의 인산염 완충 식염수 | ThermoFisher | 14190094 | 또는 동등한 |
| Easy 50 EasySep 자석 | Stemcell | 18002 | 1 x 50ml 원뿔형 튜브 |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit를 | Stemcell | 19666 | 여기에는 " 아이솔레이션 칵테일" 그리고 " RapidSpheres 자석 구슬 |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf 원심분리기 5417R 원심분리기 | Eppendorf | ||
| Ethanol, 스프레이 병 | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| 아이스 | |||
| 이소프로판올 (무수 등급) | 시그마 | 278475 | |
| 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 % (v / v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β - 글리세로 인산염, 5 mM 피로 인산 나트륨, 0.27 M 자당, 0.1 % (v / v) β -메르 캅토 에탄올, 1x cOmplete (EDTA 무료) 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche), 1 μ g/ml 마이크로시스틴-LR, 0.5mM 디이소프로필플루오로포스페이트(DIFP). | 또는 MRC-PPU 시약(http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)에서 사용 가능한 Microcystin-LR, DIFP 없이 분취액의 동결 용해 완충액 | ||
| Merck LRRK2 억제제 II(MLi-2), | Merck | 438194-10MG | 또는 동급(강력하고 선택적인 LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | DMSO에 1 mg/ml 재고 및 -80 oC에서 보관 |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx 스캔 웨스턴 블롯 이미징 시스템 | Odyssey | ||
| 영구 마커 펜 | |||
| 개인 보호 장비 | |||
| RPMI 1640 중간 | ThermoFisher | 21875034 | 또는 동급 |
| 의 피로인산나트륨 | Sigma | S22 | |
| 수크로오스 | Sigma | S0389 | |
| β-글리세로인산 | Sigma | 50020 | |
| β-메르캅토에탄올 | Sigma | M3148 | |
| Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) 항체 [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | 1:2000 희석 |
| 사용 염소 안티 마우스 IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | :10,000 희석에서 사용 |
| 염소 안티 마우스 IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | :10,000 희석에서 사용 |
| 염소 안티 토끼 IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | 1:10,000 희석에서 사용 |
| MJFF-total Rab10 마우스 항체 | nanoTools (nanotools.de) | 해당 없음 * | 2 &mu에서 사용; g/ml 최종 농도; * nanoTools (www.nanotools.de) [11]에 의해 생성된 MJFF-total Rab10 항체는 2018년에 Michael J Fox Foundation에 의해 상업화될 예정입니다 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus | 항체 항체 통합& | nbsp; 75-253 | 1 &mu에서 사용; g/ml 최종 농도 |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU 시약 및 서비스 | UDD2 | 1 &mu에서 사용; g/ml 최종 농도 |
참고문헌
- Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Fell, M. J., et al.
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