Microelektrode impalement methode om membraan potentieel van een gecanuleerde middelste cerebrale slagader record

Summary

Het primaire doel van dit artikel is om de details van hoe het membraanpotentiaal (V_m) van het midden cerebrale slagader met behulp van de microelektrode impalement methode te bieden. De gecanuleerde middelste cerebrale slagader is geëquilibreerd te krijgen myogene Toon, en het schipmuur is Impaled met behulp van hoge weerstand microelektrodes.

Abstract

Membraanpotentiaal (V_m) van vasculaire gladde spiercellen bepaalt het vaartuig Toon en dus de bloedtoevoer naar een orgaan. Veranderingen in de expressie en functie van ionenkanalen en electrogenic pompen die te reguleren V_m in ziekte omstandigheden zou kunnen veranderen v_m, vasculaire Toon, en de bloedstroom. Aldus, is een basisbegrip van Elektrofysiologisch en de methodes noodzakelijk om V_m in gezonde en zieke staten nauwkeurig te registreren essentieel. Deze methode kan moduleren V_m met behulp van verschillende farmacologische middelen te herstellen v_m. Hoewel er verschillende methoden, elk met zijn voor-en nadelen, dit artikel biedt protocollen voor het opnemen V_m van gecanuleerde weerstand schepen zoals het midden cerebrale slagader met behulp van de microelektrode impalement methode. Middelste cerebrale slagaders zijn toegestaan om myogene Toon te krijgen in een myograph kamer, en het schipmuur is inpaled met behulp van hoge weerstand microelektrodes. Het V_m -signaal wordt verzameld via een elektrometer, gedigitaliseerd en geanalyseerd. Deze methode zorgt voor een nauwkeurige lezing van de V_m van een vaatwand zonder beschadiging van de cellen en zonder de membraan weerstand te veranderen.

Introduction

Het membraanpotentiaal (V_m) van een cel verwijst naar het relatieve verschil van Ionische lading over het plasmamembraan en de relatieve permeabiliteit van het membraan naar deze ionen. De V_m wordt gegenereerd door de differentiële verdeling van ionen en wordt onderhouden door ionenkanalen en pompen. De ionenkanalen zoals K⁺, na⁺, en cl⁻ dragen wezenlijk tot het rusten V_mbij. Vasculaire gladde spiercellen (VSMCs) Express meer dan vier verschillende soorten K⁺ kanalen¹, twee soorten van voltage-gated CA^{2 +} kanalen (VGCC)², meer dan twee soorten cl⁻ kanalen^{3, 4 , 5}, op te slaan-bediend CA^{2 +} kanalen⁶, Stretch-activated kation kanalen^7,8, en electrogenic natrium-kalium ATPase pompen⁹ in hun plasmamembranen, die allemaal kunnen worden betrokken bij de regulering van V_m.

De V_m van VSMCs hangt af van lumen druk. In niet-drukvaten, V_m varieert van-50 tot-65 mv, echter, in onder druk gezette arteriële segmenten, v_m varieert van-37 tot-47 MV¹⁰. Elevatie van intravasculaire druk oorzaken VSMCs te depolariseren¹¹, vermindert de drempel voor VGCC opening, en verhoogt de calcium instroom bij te dragen tot de ontwikkeling van myogene Toon¹². Integendeel, in passieve of niet-drukvaten, membraan hyperpolarisatie, als gevolg van hoge K⁺ kanaal activiteit, zal voorkomen dat VGCC van de opening, wat resulteert in een beperkte calcium binnenkomst en een daling van de intracellulaire calcium, bij te dragen tot minder vasculaire Toon¹³. Zo, V_m als gevolg van veranderingen in de lumen druk lijkt te spelen een essentiële rol in de vasculaire Toon ontwikkeling, en zowel VGCC en K⁺ kanalen spelen een cruciale rol in de regulering van V_m.

V_m varieert tussen Scheepstype en soort. V_m is-54 ± 1,3 mv in proefkonijn superieure mesenterica arteriële stroken¹⁴,-45 ± 1 mv in de rat midden cerebrale slagaders op 60 mmHg lumen druk¹², en-35 ± 1 mv in rat parenchymale slagaders op 40 mmHg lumen druk¹⁵. De rust V_m opgenomen in ongestrekte rat lymfatische spier is-48 ± 2 MV¹⁶. V_m van cerebrale VSMCs is negatiever dan in perifere slagaders. Ter vergelijking, katachtige middelste cerebrale slagaders werden gemeld aan een V_m van ongeveer-70 mV hebben, terwijl mesenterica en kransslagaders werden gemeld te hebben-49 en-58 mv, respectievelijk^17,18. Verschillen in de V_m over vasculaire bedden kunnen weerspiegelen de verschillen in de expressie en functie van ionenkanalen en electrogenic natrium-kalium pompen.

De verhogingen en de dalingen in V_m worden bedoeld als membraan depolarisatie en hyperpolarisatie, respectievelijk. Deze veranderingen in V_m spelen een centrale rol in vele fysiologische processen, met inbegrip van ionen-kanaal gating, cel signalering, spiercontractie, en actie potentiële propagatie. Bij een vaste druk, veroorzaken vele endogene en synthetische vaatverwijdende samenstellingen die K⁺ kanalen activeren membraan hyperpolarisatie, resulterend in vasodilatatie^1,13. Omgekeerd, aanhoudende membraan depolarisatie is van vitaal belang in agonist-geïnduceerde of receptor-gemedieerde vasoconstrictie¹⁹. V_m is een kritische variabele die niet alleen reguleert CA^{2 +} instroom door VGCC¹³ , maar ook van invloed op de release van CA^{2 +} van interne winkels^20,21 en CA^{2 +}-gevoeligheid van het samentrekbaar apparaat²².

Hoewel er verschillende methoden om V_m record van verschillende soorten cellen, gegevens verzameld uit de microelektrode impalement methode van gecanuleerde schepen lijkt meer fysiologische dan de gegevens verkregen uit geïsoleerde VSMCs. Wanneer geregistreerd van geïsoleerde VSMC gebruikend huidige klem methodes, wordt V_m gezien als spontane voorbijgaande Hyperpolarizations in VSMCs²⁴. Geïsoleerde VSMCs zijn niet in de syncytium, en de veranderingen in de reeks weerstand kan bijdragen tot de oscillerende gedrag van V_m. Aan de andere kant, oscillerende gedrag wordt niet waargenomen wanneer V_m is opgenomen van intacte schepen, waarschijnlijk te wijten aan cel-cel contact tussen VSMCs die in syncytium in de slagader en zijn gesommeerd door het hele schip leidt tot een stabiele V_m ²⁴. aldus, is de meting van V_m van onder druk gezette schepen gebruikend standaard microelektrode impalement techniek vrij dicht bij de fysiologische voorwaarden.

Opname V_m van gecanuleerde schepen kunnen vitale informatie, aangezien v_m van VSMCs die in syncytium is een van de belangrijkste determinanten van vasculaire Toon en de doorbloeding, en de modulatie van de v-_m kan een manier om verwijden of vernauwen bloedvaten. Zo is het essentieel om te begrijpen van de methodologie die betrokken zijn bij de opname V_m. Dit artikel beschrijft intracellulaire opname van V_m van gecanuleerde middelste cerebrale slagaders (MCAs) met behulp van een microelektrode impalement methode. Dit protocol zal beschrijven hoe te bereiden MCAs, microelektrodes, het opzetten van de elektrometer en uitvoeren van de impalement methode om V_mrecord. Ook representatieve gegevens, gemeenschappelijke problemen die werden aangetroffen bij het gebruik van deze methode en mogelijke problemen worden besproken.

Protocol

De mannelijke ratten werden gehuisvest in de Dierenzorg faciliteit op UMMC, die is goedgekeurd door de vereniging voor de beoordeling en accreditatie van laboratoriumdieren zorg (AAALAC). Dieren hadden gedurende de hele studie vrije toegang tot voedsel en water. De dieren werden gehandhaafd in een gecontroleerde omgeving met temperatuur bij 24 ± 2 °C, vochtigheidsniveaus van 60 – 80% en 12 h lichte/donkere cycli. Alle protocollen werden goedgekeurd door de Dierenzorg en het gebruik Comite van UMMC. <p class="jove…

Representative Results

De gepresenteerde methode kan betrouwbaar worden gebruikt voor het opnemen Vm in gecanuleerde schepen. In Figuur 1awordt een korte procedure beschreven om MCA van de hersenen te isoleren. Na het scheiden van de hersenen van de schedel, werd het MCA ontleed en geplaatst in een Petri schaaltje met een laag calcium PSS. Een deel van het bindweefsel dat werd gehecht werd ook ontleed samen met MCA met behulp van de lente schaar en Tang om schade aan MCA…

Discussion

Dit artikel bevat de nodige stappen op het gebruik van een scherpe microelektrode impalement methode om V_m record van een gecanuleerde schip voorbereiding. Deze methode wordt veel gebruikt, en biedt een hoge kwaliteit, consistente opnames van V_m dat antwoord op een breed scala van experimentele vragen.

Sommige kritieke overwegingen en stappen voor probleemoplossing worden hier beschreven om het succes van de methode te garanderen. De kwaliteit van de micro-elektrode (de s…

Materials

Dissection instruments
Aneshetic Vaporiser	Parkland scientific	V3000PK
Dissection microscope	Nikon Instruments Inc., NY	Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575	Harvard Apparatus, MA	73-198
Littauer Bone Cutter	Fine science tools	16152-15
Moria MC40 Ultra Fine Forceps	Fine science tools	11370-40
Surgical scissors Sharp-Blunt	Fine science tools	14008-14
Suture	Harvard Apparatus	72-3287
Vannas Spring Scissors	Fine science tools	15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device camera	Qimaging, , BC	Retiga 2000R
Differential electrometer amplifier	WPI	FD223A
In-line pressure transducer	Harvard Apparatus, MA	MA1 72-4496
Micromanipulator	Thor labs	PCS-5400
Microelectrodes	Warner Instruments LLC, CT	G200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe)	WPI	MF28G67-5
Microelectrode holder	WPI	MEH1SF
Myograph	Living Systems Instrumentation, VT	CH-1-SH
Puller	Sutter Instrument, San Rafael, CA	P-97
Vibration-free table	TMC	3435-14
Softwares
Clampex 10	Molecular devices
p Clamp 10	Molecular devices
Imaging software	Nikon, NY	NIS-elements
Chemicals
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P4504
MgSO4	Sigma	M7506
CaCl2	Sigma	C3881
HEPES	Sigma	H7006
Glucose	Sigma	G7021
NaH2PO4	Sigma	S0751
NaHCO3	Sigma	S5761