Summary

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

Published: March 23, 2020
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Summary

複雑な生体試料から生じるユビキチン化タンパク質を起源とするdiGlyペプチドの精製、検出、同定方法を紹介します。提示された方法は、ユビキチノメ分析の深さのレベルに関して、再現性、堅牢性、および優れたメソッドを上回る。

Abstract

ユビキチンの小さなタンパク質によるタンパク質の翻訳後修飾は、多くの細胞イベントに関与しています。ユビキチン化タンパク質のトリプティック消化後、リジンのイプシロンアミノ基に結合したデグリシン残骸を有するペプチド(‘K-ε-diglycine’または単に「diGly」)を使用して、元の改変部位を追跡することができます。質量分析による感度検出と組み合わせたdiGlyペプチドの効率的な免疫精製は、最新のユビキチン化部位の数を大幅に増加させた。濃縮手順の前に、ペプチドのオフライン高pH逆相分画、イオンルーティング多極に、より高度なペプチド断片化設定を含めることなど、このワークフローにいくつかの改良を加えました。また、抗体ビーズを保持するためにフィルタベースのプラグを使用したサンプルのクリーンアップがより効率的に行われるため、diGlyペプチドに対する特異性が高くなります。これらの改善は、ヒト子宮頸癌細胞(HeLa)細胞の細胞リセートから23,000以上のdiGlyペプチドを細胞内のプロテアソーム阻害時に日常的に検出する結果となる。我々は、脳組織などのいくつかの異なる細胞型およびインビボサンプルのユビキチノメプロファイルの詳細な分析のためのこの戦略の有効性を示す。本研究は、深い細胞ユビキチノメを明らかにするためのタンパク質ユビキチン化分析のためのツールボックスにオリジナルの追加を提示します。

Introduction

ユビキチンからタンパク質への結合は、プロテアソームによる分解を示すものであり、プロテオスタシスにおいて重要なプロセスです。ユビキチンのC末端カルボキシル基は、標的タンパク質11,22のリジンε-アミノ基とイソペプチド結合を形成する。また、ユビキチンは他のユビキチンモジュールに付着することができ、その結果、均質(すなわち、K48またはK11)または分岐(すなわち、不均質または混合)のポリウビキチン構造11、33の形成をもたらす。ユビキチンの最もよく知られた機能は、プロテアソーム分解におけるその役割であり、K48結合ポリウビキチンによって媒介される。しかし、モノ-とポリユビキチン化の両方が、プロテアソームによる分解とは無関係な多くのプロセスにおいて役割を果たしていることも明らかになっている。例えば、K63連結鎖は、細胞内密売、リソソーム分解、キナーゼシグナル伝達、およびDNA損傷応答44,55において非分解的役割を有する。他の6つのリンケージタイプはあまり豊富ではなく、その役割は依然としてほとんど謎めいているが、細胞内のそれらの機能に関する最初の徴候は、主にリンケージ特異的検出66、77を可能にする新しいツールの開発のために出現している。

質量分析はプロテオーム解析に欠かせないツールとなっており、現在では、事実上あらゆる生物学的源から数千種類の異なるタンパク質を1回の実験で同定することができます。複雑さの追加の層は、タンパク質活性を調節することができるタンパク質の翻訳後修飾(PTM)のタンパク質(例えば、リン酸化、メチル化、アセチル化、ユビキチン化)によって提示される。PTMを含むタンパク質の大規模同定は、質量分析分野の発展によっても可能となっています。PTMを持つペプチドの比較的低い化学測定は、その非修飾の対応物と比較して技術的な課題を提示し、一般的に質量分析の前に生化学的濃縮ステップが必要です。過去20年間、PTMの分析のためにいくつかの異なる特異的な濃縮方法が開発されました。

細胞内のタンパク質ユビキチン化の多面的役割のため、タンパク質8上のユビキチン化部位の検出のための分析方法の開発に大きな需要がある。,質量分析法の適用は、フルーツフライ、マウス、ヒト、および酵母タンパク質,,9、10、11、12、13、1410,中の9同定されたユビキチン化部位の数の爆発に至った111213主要なステップは、K-ε-GGレムナントモチーフ(‘diglycine’または「diGly」とも呼ばれる)に対する抗体を用いたペプチドレベルでの免疫沈降ベースの濃縮戦略の開発によって提示された。これらのdiGlyペプチドは、プロテアーゼ15、16,16としてトリプシンを使用してユビキチン化タンパク質の消化時に産生される。

ここでは、眼窩質量分析法による免疫精製とその後の検出を用いて、diGlyペプチドを濃縮するための最適化されたワークフローを提示する。既存のワークフローのいくつかの変更の組み合わせを使用して、特にサンプル調製および質量分析段階で、プロテアソームで処理されたHeLa細胞の単一サンプルから23,000以上のdiGlyペプチドを日常的に同定できるようになりました。阻害剤および、治療されていないHeLa細胞から〜10,000。このプロトコルは、細胞培養中のアミノ酸による標識のない安定同位体(SILAC)のHeLa細胞と脳組織などの内因性サンプルの両方に、このプロトコルを適用しました。

このワークフローは、深いユビキチノメを明らかにするために、ユビキチン化部位の分析のためのツールのレパートリーに貴重な追加を提示します。次のプロトコルは、ワークフローのすべての手順を詳細に説明します。

Protocol

ここに記載されているすべての方法は、エラスムスMCの制度的動物のケアと使用委員会(EDC)によって承認されています。 1. サンプル準備 培養細胞 目的の細胞株(例えば、HeLaまたは骨肉腫[U2OS]細胞)を選択し、10%の熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)および100単位/mLペニシリン/ストレプトマイシンを補ったDulbeccoのミニマルイーグルミディアム(DMEM)の細胞を成長させま…

Representative Results

ユビキチン化されたタンパク質は、タンパク質がトリプシンで消化されると、標的リジン残基に114.04ダジグリシン残骸を残します。このモチーフによって引き起こされる質量差は、質量分析実験においてユビキチン化の部位を明確に認識するために用いられた。ここで説明する戦略は、ナノフローLC-MS/MSによるdiGlyペプチドの濃縮とその後の同定のための最先端の方法…

Discussion

ここで説明するプロトコルは、培養細胞および生体組織などの様々な生物学的源からのサンプルに適用された。すべてのケースで、我々は、総タンパク質入力量が少なくとも1mgであることを提供し、数千のdiGlyペプチドを同定した。ユビキチン化タンパク質またはジグリーペプチドの濃縮手順が適用されていない場合、細胞全体のライセートから同定されたのは、100-150個の非常に低いジグリ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、オランダ科学研究機構(NWO)が国家ロードマップの大規模研究施設(プロジェクト番号184.032.201)の一環として資金を提供するオランダ・プロテオミクス・センターのプログラム「プロテインズ・アット・ワーク」の一環です。).

Materials

1,4-Dithioerythritol Sigma-Aldrich D8255
3M Empore C18 Octadecyl disks Supelco 66883-U product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)
Ammonium formate Sigma-Aldrich 70221
Bortezomib UBPbio
CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å Waters
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 34869
DMEM ThermoFisher
EASY-nanoLC 1200 ThermoFisher
FBS Gibco
GF/F filter plug Whatman 1825-021
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125
Lysine, Arginine Sigma-Aldrich
Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) Cambridge Isotope Laboratories
Lysyl Endopeptidase(LysC) Wako Pure Chemicals 129-02541
NanoLC oven MPI design, MS Wil GmbH
N-Lauroylsarcosine sodium salt Sigma-Aldrich L-5125
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer ThermoFisher
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher / Pierce 23225
PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles Agilent Technologies PL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit Cell Signaling Technologies 5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge Waters WAT036790 Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970
Tris-base Sigma-Aldrich T6066
Tris-HCl Sigma-Aldrich T5941
Trypsin, TPCK Treated ThermoFisher 20233

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Cite This Article
Bezstarosti, K., van der Wal, L., Demmers, J. A. A. Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (157), e59079, doi:10.3791/59079 (2020).

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