펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

요약

우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.

초록

작은 단백질 유비퀴틴에 의한 단백질의 번역 후 변형은 많은 세포 이벤트에서 관여한다. 유비퀴틴화된 단백질의 트리펩티드 소화 후, 리신의 엡실론 아미노 그룹('K-θ-디글리신' 또는 단순히 'diGly')에 컨쥬게이징된 디글리신 잔재를 함유한 펩티드를 원래의 수정 부위를 추적하는데 사용할 수 있다. 질량 분석법에 의한 민감한 검출과 결합된 diGly 펩티드의 효율적인 면역정화는 현재까지 확인된 유비퀴틴화 부위의 수가 크게 증가하였다. 우리는 농축 절차 이전에 펩타이드의 오프라인 높은 pH 역상 분획및 이온 라우팅 멀티폴에 보다 진보된 펩티드 단편화 설정을 포함하는 이 워크플로우를 몇 가지 개선했습니다. 또한, 항체 비드를 보유하기 위해 필터 기반 플러그를 사용하여 시료를 보다 효율적으로 정리하면 diGly 펩티드에 대한 더 큰 특이성을 초래한다. 이러한 개선은 인간 자궁 경부암 세포 (HeLa) 세포에서 23,000 개 이상의 diGly 펩티드의 일상적인 검출을 초래하여 세포에서 프로테아좀 억제에 따라 용해됩니다. 우리는 몇몇 다른 세포 모형및 두뇌 조직과 같은 생체 내 견본의 보편성 프로파일의 심층 분석을 위한 이 전략의 효험을 보여줍니다. 이 연구는 깊은 세포 유비퀴티노메를 밝히기 위해 단백질 유비퀴틴 분석을 위한 도구 상자에 원래 추가된 것을 제시합니다.

서론

단백질에 유비퀴틴의 융합은 프로테아솜에 의한 분해를 표시하고 프로테오스타증에서 중요한 과정입니다. 유비퀴틴의 C 말단 카르복실 그룹은 표적 단백질^1,,2의리신 θ-아미노 기와 이소펩티드 결합을 형성한다. 또한, 유비퀴틴은 다른 유비퀴틴 모듈에 부착될 수 있으며, 이로 인해 균질한(즉, K48 또는 K11) 또는 분기(즉, 이질성 또는 혼합) 폴리유비퀴틴^{구조1,,3의}형성을 초래한다. 유비퀴틴의 가장 잘 알려진 기능은 K48 연결 폴리유비퀴틴에 의해 매개된 프로테소말 분해에서의 역할입니다. 그러나, 모노-뿐만 아니라 polyubiquitination 또한 proteasome에 의한 분해와 무관하게 많은 프로세스에서 역할을 한다는 것이 분명해졌습니다. 예를 들어, K63 연결 체인은 세포 내 인신 매매, 리소좀 분해, 키나아제 신호 및 DNA 손상 반응^4,,5에서비분해적 역할을 합니다. 다른 6개의 연계 유형은 덜 풍부하고 그들의 역할은 여전히 대체로 수수께끼이지만, 세포에서의 기능에 ....

프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 에라스무스 MC의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(EDC)에 의해 승인되었습니다.

1. 견본 준비

1. 배양 된 세포
   1. 관심 있는 세포주(예: HeLa 또는 골육종 [U2OS] 세포)를 선택하고 10% 열 불활성화 태아 소 혈청(FBS)과 100 단위/mL 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 덜베코의 최소 독수리 배지(DMEM)에서 세포를 성장시다.
   2. 정량적 프로테오믹스 실험의 경우, DMEM의 배양 세포는 아르기닌과 리신이 결여되어 있다. 배지는 10% 투석소 혈청(FBS), 100 단위/mL 페니실린/스트렙토마이신, 알라닌 글루타민으로 보충되어야 합니다. 기존의 리신과 아르기닌('Light' Medium) 또는 리신-8(13C¹³_6)을 ^{추가하여 두 가지 유형의 미디어를 만드십시오. 15}N₂₎및 아르기닌-10⁽¹³C_6; ¹⁵N₄₎('헤비 미디엄') 각각.
   3. 광배지(즉, 표지되지 않은) 및 중형배지(즉, 표지되지 않은 SILAC)에서 세포의 배양 배치를 확장 및 치료 전에 적어도 6배 이상 배배화하여 중....

결과

유비퀴틴화 단백질은 단백질이 트립신으로 소화될 때 대상 리신 잔류물 위에 114.04 Da 디글리신 잔재를 남깁니다. 이 모티프에 의한 질량 차이는 질량 분석 실험에서 유비퀴틴화 부위를 명확하게 인식하는 데 사용되었습니다. 여기서 설명하는 전략은 나노흐름 LC-MS/MS에 의한 diGly 펩티드의 농축 및 후속 식별을 위한 최첨단방법(그림 1A)입니다. 본 연구에서, 배양된 세포와 생체 내 물질 모두 단백질의 생물학적 공급원으로 사용되었지만, 이 프로토콜은 단백질의 임의의 공급원과 호환된다. 프로토콜의 단계에 따라 단백질 입력의 2-20 mg에서 10,000-25,000 diGly 펩티드를 확인하는 것이 간단해야한다. 세포에서 단백질 유비퀴틴화의 정도를 증가시키기 위해, 보르테조미브 또는 MG132와 같은 프로테아좀 억제제는 세포를 수확하기 몇 시간 전에 첨가될 수 있다. 프로테아좀 억제.......

토론

여기서 기재된 프로토콜은 배양된 세포 및 생체내 조직과 같은 다양한 생물학적 공급원으로부터의 샘플에 적용되었다. 모든 경우에 우리는 diGly 펩티드의 수천을 확인, 총 단백질 입력 량이 적어도 이었다는 것을 제공 1 mg. 특이적 항체를 이용한 농축은 유비퀴틴화 단백질 또는 diGly 펩티드에 대한 농축 절차가 적용되지 않은 경우 전체 세포 용해물에서 만 100-150 매우 낮은 풍부한 diGly 펩티드만이 확인되었다는 점을 감안할 때 매우 효율적입니다. 분명히 민감한 질량 분석법은 많은 수의 diGly 식별을 얻기 위한 전제 조건입니다. 우리는 성공적으로 여러 가지 질량 분석기를 사용했지만, 우리는 Orbitrap Tribrid Lumos가 가장 높은 수율을 준 가장 민감한 것으로 나타났습니다.

높은 pH 용출이 있는 오프라인 RP 크로마토그래피는 IP가 수행되기 전에 테스트되어야 합니다. 펩티드 식별의 관점에서 분획 사이의 중첩은 최적의 실험을 위해 가능한 한 낮아야 한다........

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1,4-Dithioerythritol	Sigma-Aldrich	D8255
3M Empore C18 Octadecyl 디스크	Supelco	66883-U	제품은 Supelco에서 단종되었습니다. CDS Analytical은 새로운 제조업체 (https://www.cdsanalytical.com/empore)
포름산 암모늄	시그마 - 알드리치	70221
Bortezomib	UBPbio
CSH130 수지, 3.5 μ m, 130 Å	Waters
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	34869
DMEM	ThermoFisher
EASY-nanoLC 1200	ThermoFisher
FBS	Gibco
GF/F 필터 플러그	Whatman	1825-021
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I6125
라이신, 아르기닌	시그마-알드리치
라이신-8 (13C6; 15N2), 아르기닌-10 (13C6; 15N4)	Cambridge Isotope Laboratories
Lysyl Endopeptidase(LysC)	Wako Pure Chemicals	129-02541
NanoLC 오븐	MPI 설계, MS Wil GmbH
N-Lauroylsarcosine 나트륨 염	Sigma-Aldrich	L-5125
Orbitrap Fusion Lumos 질량 분석기	ThermoFisher
Pierce BCA 단백질 분석 키트	ThermoFisher / Pierce	23225
PLRP-S (300 Å, 50 & micro; m) 고분자 역상 입자	Agilent Technologies	PL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit	Cell Signaling Technologies	5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac 카트리지	Waters	WAT036790	으로 카트리지를 채우기 전에 카트리지에서 tC18 재료를 제거하십시오
Tris-base	Sigma-Aldrich	T6066
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Trypsin, TPCK 처리	ThermoFisher	20233

PLRP-S Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970.