アグロバクテリウムとサツマイモネコブセンチュウ-ジャガイモの変換を介したと GUS 染色によってスベリン遺伝子のプロモーター活性
Summary
ここでは、ジャガイモを変換する 2 つのプロトコルを提案する.サツマイモネコブセンチュウ生成トランスジェニック植物毛状根自己伝達することができます野生型撮影アグロバクテリウム変換完了形質転換植物に します。我々 は、ガス変換された根の染色によるプロモーター活性を検出します。
Abstract
アグロバクテリウムの sp は、転送および独自の T-DNA を植物のゲノムに統合する能力があり、形質転換植物を得る最も広く使用されている方法の一つです。ここでは、遺伝子組み換えポテト (ジャガイモ) 植物を変更する 2 つの変換システムを提案する.A. 根頭がんしゅ病菌の変換で葉が感染している、変換されたセルが選択されて、新しい完全な形質転換体が 18 週間でホルモンを使用して再生成されます。A. 体の獲得変換で茎は針で細菌を注入することにより感染している、新登場の変換された毛状根は赤い蛍光マーカーを使用して検出されます、非変形の根が削除されます。5-6 週間で得られた植物は完全に開発された変換された毛状根と野生型撮影のコンポジットです。バイオマスの増加に変換された毛状根は摘出し、自己反映できます。我々 は両方アグロバクテリウム-仲介された変換方法スベリン生合成遺伝子プロモーターによるGUSレポーター遺伝子を表現する根を取得するを適用されます。GUS 染色手順は、プロモーター発現誘導の細胞局在化をことができます。両方の方法で変換したバレイショの根を示した GUS GUS 活性 suberized 内皮、外皮、およびさらに、 A. 体の獲得変換根を染色も根の出現で検出されました。A. 体の獲得が根に表現される遺伝子を研究する高速代替ツールをすることができますが示唆されました。
Introduction
経済的利益は別として遺伝子組換え植物の世代は、独自の関連性研究遺伝子の究極の機能を示すため、植物生理学と開発を理解します。最も広く法植物 DNA の挿入はアグロバクテリウム-変換を介した。アグロバクテリウムは、その腫瘍を誘発する (Ti) プラスミドの作用によって多くの植物種の感染組織におけるクラウン苛立つを生成することです。プラスミドには、植物ゲノムに組み込まれる予定、組織分化1,2を誘発する遺伝子のセットを持つ T DNA 領域が含まれています。遺伝子による T DNA 内でこれらの遺伝子の交換は表現型効果3を回避する特定の植物の変更の生成を許可しています。T DNA へのクローニング遺伝子のため、Ti プラスミドの遺伝子の残り中のバイナリのプラスミドと呼ばれる独立したプラスミドの DNA 領域が削除されて (T-DNA 転送と挿入メカニズムを許可する病原性遺伝子) がされています。ヘルパー プラスミドに配置されます。A. 根頭がんしゅ病菌による変換は、植物バイオ テクノロジー研究、いくつかの利点: それは高価な装置を必要としない、安定性と過渡工場変換とコピーに統合されている遺伝子の低い数字の両方を生成することができる、染色体4。ただし、ほとんどの植物がないシロイヌナズナ,安定形質転換細胞の生成に単一または外因性ホルモンは、骨の折れる、時間がかかり、このプロセスを作るを使用して少数の細胞からの植物体再生が必要です。A. 体の獲得は植物ゲノムを変更することができます毛状根や不定根 (Ri) のルート誘導プラスミド5でエンコードされたrol (根軌跡) 遺伝子の発現による感染部位での生産します。A. 根頭がんしゅ病菌より少ないが、 A. 体の獲得も遺伝子ルーツを取得する使用されます。この場合、 a. 体の獲得には、2 番目 T-DNA 遺伝子を運ぶとで Ri プラスミドとバイナリのプラスミッドの T-DNA 元にはが含まれています。感染サイトが茎や胚軸、野生型撮影から新興新しい毛深い遺伝子ルーツを持つ、複合植物が得られます。また、変換された毛状根育つことが自律的体外炭素ソース入力メディアで。A. 根頭がんしゅ病菌遺伝子組換え組織を生成するのではなくa. 体の獲得の使用は植物体再生は必須ではありません、それ故にそれはより速くより少なく高価なためルートに標的臓器と関連性を得ています。以前の研究は、ルート特定の遺伝子6,7,8,9表現型特性の充当方法論を実証しています。
塊茎はビタミンの良いソースであることの人間の消費のための栄養の関連性を持っているので、じゃがいも (ジャガイモ) は食糧および農業機構の国際連合 (FAO) によれば、世界で第 4 最も重要な作物やミネラル。そのため、ジャガイモは、農業バイオ テクノロジーのスポット ライトに置かれているし、遺伝と発達の良い生体モデルの研究10,11としてまた考慮されます。ジャガイモの変換は遺伝子の特徴を基になる suberized 組織スベリンに関与し、生合成12,13,14 をワックスの分子機構の理解に貢献 ,,1516,17、スベリン モノマーのトランスポート18と転写調節の19。FHT、スベリン フェルロイル トランスフェラーゼ遺伝子はこれらの特徴生合成遺伝子の 1 つそのダウンレギュレーションがスベリン型フェルラ酸エステルの強い減少やジャガイモ塊茎14ワックスと相関周皮の保護の強い障害を生じさせる。付随して、根およびシロイヌナズナの種子は、その推定の細胞 (ASFT/RWP1) のノックアウトもスベリン20,21アルキル ferulates の生産に於いての役割を示した。ジャガイモ、 FHT転写記者行と FHT 抗体を示したプロモーター活性およびタンパク質、外皮、内皮細胞は、一層誘導体と傷ついた組織15に位置して.
この作品は、 a. 体の獲得を使用して野生型撮影で保持されている遺伝子組換えの毛状根を生成する、複合ジャガイモ植物の生成や体外の自律的成長を摘出プロトコルを詳しく説明します。A. 根頭がんしゅ病菌を使用して完全なトランスジェニックバレイショを取得するプロトコルもあります。事例研究としてA. 体の獲得とA. 根頭がんしゅ病菌と同じバイナリ ベクトル変換は、 GUSレポーター遺伝子発現を運転FHTプロモーターと根を取得する使用されます。結果報告し、比較します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ジャガイモ, 安定した完全な遺伝子組換え植物を取得する最も一般的なシステムは、外因性のホルモンを使用して器官を必要とアグロバクテリウム菌株によって変換を使用します。アグロバクテリウムによるプロトコル非 T DNA ベクター シーケンス25を統合する潜在性があるが、この方法は、まだ最も、安価バレイショを変換できます。A. 体の獲得に関心?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ジローナ大学 (博士号付与 SF とグラントと資金 (AGL2012 36725, AGL2015 67495 C2 1 R) のフェダー Ministerio デ Economía y Competitividad Ministerio デ Innovación y サイエンス (AGL2009 13745、PB に FPI グラント) によって支えられました。SING11/1)。A. 体の獲得とA. 根頭がんしゅ病菌株を提供するため、著者は博士インゲ Broer (ドイツ ・ ロストック市土地利用、ロストック大学研究所) および博士サロメ ・ プラット (セントロ ナシオナル ・ デ ・ Biotecnología、マドリード、スペイン) に感謝してそれぞれ、博士施されたソレルとヘルプとサポートA. 体の獲得変換実験を開始する受信博士アンナ プラセンシア (トゥールーズ III ポール ・ サバティエ大学、CNRS、植物研究所 (LRSV)、カスタネット Tolosanフランス)。著者は研究所の仕事の遂行としていた間、実験のいくつかの植物・ フェラン Fontdecaba くださったカーラ ・ サンチェスの世話で彼女の貴重な援助ありがとうサラ ・ ゴメス (局・ デ ・ Biologia、UdG、ジローナ)彼らの最終的な程度のプロジェクト。
Materials
|
Acetone |
Panreac |
1.310.071.21 |
|
|
Acetosyringone |
Acros |
115540050 |
|
|
Aquarium pump |
Prodac |
MP350 |
|
|
Autoclave |
Ragpa Strelimatic |
||
|
Bacteriological agar |
Lab Conda |
1800 |
|
|
BAP |
Duchefa |
B0904 |
|
|
Beef extract |
Lab Conda |
1700 |
|
|
Plant growing cabinet |
Nuaire |
||
|
Carbenicillin |
Duchefa |
C0109 |
|
|
Cefotaxime sodium |
Duchefa |
C0111 |
|
|
DMSO |
Merck |
1029310161 |
|
|
Ecotron infors |
HT |
29378 |
|
|
Ethanol |
Merck |
1,009,831,011 |
|
|
Falcon tube |
Control tecnica |
CFT011500 |
|
|
Ferricyanate |
Sigma |
101001081 |
|
|
Ferrocyanate |
Sigma |
100979088 |
|
|
Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture |
Apiglass |
ref16 |
|
|
GA3 |
Sigma |
G7645 |
|
|
Gamborg B5 media |
Duchefa |
G0210 |
|
|
Gelrite |
Duchefa |
G1101 |
|
|
Glucosa |
Sigma |
G5767 |
|
|
Kanamycin |
Sigma |
K1377 |
|
|
Leukopor tape |
BSN Leukopor |
BDF47467 |
|
|
Lupe |
Wild-Heerbrugg |
M420 |
|
|
Magnetic shaker |
Agimatic |
7000243 |
|
|
MES hydrate |
Sigma |
M2933-25G |
|
|
MgSO4 |
Panreac |
131404 |
|
|
Microscope |
Olympus |
||
|
Minufugue centrifugue 5415R |
Eppendorf |
||
|
Murashige and Skoog media |
Duchefa |
M0254.0050 |
|
|
Na2HPO4 |
Panreac |
131679 |
|
|
NAA |
Duchefa |
N0903 |
|
|
NaCl |
Panreac |
131659 |
|
|
NaH2PO4 |
Sigma |
58282 |
|
|
NightSea Stereo |
SFA Moonting Adapter |
||
|
Parafilm |
Anorsa |
PRFL-001-001 |
|
|
Peptone |
Lab Conda |
1616 |
|
|
Petri dishes (90 x 14) |
Anorsa |
200200 |
|
|
pHmetre |
Crison |
||
|
Phytotron |
Inkoa |
RFTI-R5485 |
|
|
Plant Agar |
Duchefa |
P1001 |
|
|
Refrigeratot |
Liebherr Medline |
||
|
Rifampicin |
Duchefa |
R0146 |
|
|
Spectinomycin |
Sigma |
59007 |
|
|
Spectrophotometer |
Shimadzu |
||
|
Square plates (120 x 120) |
Deltalab |
200204 |
|
|
Streptomycin |
Sigma |
S6501 |
|
|
Sucrose |
Panreac |
131621 |
|
|
Surgical blades |
Swann-Morton |
201 |
|
|
Surgical needle |
NIPRO |
015/0204 |
|
|
Triptone |
Lab Conda |
1612 |
|
|
Triton |
Serva |
37240 |
|
|
Unimax 1010 shaker |
Heidolph |
||
|
Vacuum |
Dinko |
||
|
x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous) |
Biosynth |
B-7398 |
|
|
Yeast extract |
Lab Conda |
1702.00 |
|
|
Zeatin riboside |
Sigma |
1001042850 |
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