Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes-опосредованной трансформации картофеля и промоутер активность гена суберин путем окрашивания ГАС
Summary
Здесь мы представляем два протокола для преобразования растений картофеля. Agrobacterium tumefaciens преобразование приводит к полной трансгенных растений в то время как Agrobacterium rhizogenes производит трансгенных волосатые корни в стрелять дикого типа, который может быть самостоятельной распространенный. Мы затем обнаружить промоутер активность GUS пятнать в преобразованной корни.
Abstract
Agrobacterium sp. является одним из наиболее широко используемых методов для получения трансгенных растений, поскольку он имеет возможность передачи и интегрировать свой собственный T-ДНК генома растений. Здесь мы представляем два преобразования систем генетически изменить растений картофеля (Solanum tuberosum). В A. tumefaciens трансформации зараженные листья, трансформированных клеток выбираются и новый полный преобразованные завод генерируется с использованием фитогормонов в 18 недель. A. rhizogenes трансформации стебли зараженных инъекционных бактерии с помощью иглы, новых появившихся преобразованные волосатые корни обнаруживаются с помощью маркера красных флуоресцентных и корни-трансформированных удаляются. В 5-6 недель результатом завод представляет собой совокупность дикого типа стрелять с полностью развитой преобразованные волосатые корнями. Для увеличения биомассы, преобразованные волосатые корни можно подакцизным и распространяются самостоятельно. Мы применяли оба методы трансформации Agrobacterium –опосредованной получить корни, выражая GUS Репортер ген обусловлен промоутера суберин биосинтетических генов. GUS пятная процедуру предоставляется и позволяет ячейки локализации промоутер индукции. В обоих методах корни преобразованные картофеля показал, что окрашивание в suberized эндодермы и exodermis и Кроме того, а. rhizogenes преобразован корни активность GUS GUS был также обнаружен в появление боковых корней. Эти результаты показывают, что а. rhizogenes может быть быстро альтернативных инструментом для изучения генов, которые выражаются в корни.
Introduction
Помимо экономических интересов поколение трансгенных растений имеет свою собственную значимость в исследованиях продемонстрировать конечной функции генов и лучше понять физиологии растений и развития. Наиболее широко используемый метод для растений ДНК вставки Agrobacterium-опосредованной трансформации. Agrobacterium tumefaciens способен генерировать Корона галлов в инфицированных тканях многих видов растений под действием его опухоль заставить плазмида (Ti). Плазмида содержит область T-ДНК с набором генов, которые будут интегрированы в генома растений и побудить ткани дифференцировке1,2. Обмен этих генов в T-ДНК, трансген позволила поколения изменения конкретных растений, избегая Фенотипическая воздействию3. Для облегчения трансген, клонирование в T-ДНК, регионе T-ДНК был вырезан в независимой плазмида, называемый двоичной плазмида, а остальные гены плазмида Ti были (генов вирулентности, которые позволяют механизмы передачи и вставки T-ДНК) помещены в вспомогательный плазмиды. Для исследования в области биотехнологии растений, преобразование A. tumefaciens имеет ряд преимуществ: она не нужны дорогие устройства, способен генерировать как завод стабильного и переходных преобразований, так и небольшого числа генов, копии интегрированы в хромосома4. Однако для большинства растений, но не арабидопсиса, поколение стабильной трансформантов требует регенерации растений из одного или нескольких клеток с помощью экзогенных фитогормонов, делая этот процесс трудоемкий и требует много времени. A. rhizogenes также возможность изменения генома растений, производства волосатые корни или придаточных корней на сайтах инфекции из-за экспрессию генов рол ( локусовкорень), закодированы в плазмиду вызывая корень (Ri)5. Хотя менее изучены чем A. tumefaciens, а. rhizogenes также используется для получения трансгенных корни. В этом случае, а rhizogenes содержит оригинальные T-ДНК в Ри плазмиды и двоичные плазмида с второй T-ДНК, перевозящих трансген. Когда сайт инфекции в стеблях или гипокотиля, композитный растений могут быть получены, с новой волосатые трансгенных корнями, переживших побеги дикого типа. В качестве альтернативы волосатые преобразованные корни могут расти автономно в пробирке в СМИ с входными данными источника углерода. Использование A. rhizogenes вместо A. tumefaciens производить трансгенной ткани приобретает актуальность, когда корень является органом-мишенью, потому что завод регенерации не требуется, и следовательно это быстрее и менее дорогостоящим. Предыдущие исследования показали эту методологию, ассигнованных для фенотипические характеристики корневого конкретные гены6,,78,9.
Картофеля (Solanum tuberosum) является четвертым наиболее важных сельскохозяйственных культур в мире согласно данным Продовольственной и сельскохозяйственной Организации Объединенных Наций (ФАО), поскольку клубень имеет питания актуальность для потребления человеком за то, что является хорошим источником витаминов и минералов. По этой причине картофель был помещен в центре внимания сельскохозяйственной биотехнологии и также считается хорошим биологической модели для генетических и развития исследований в10,11. Значительный вклад в понимание молекулярных механизмов базовой suberized тканей через характеристика генов, участвующих в суберин и воск биосинтез12,13,14 трансформации картофеля ,,1516,17, суберин мономера транспорт18 и транскрипции правила19. Суберин feruloyl трансферазы генов, FHT, является одним из этих характеризуется биосинтетических генов; его Даунрегуляция порождает сильное ухудшение Перидерма защиты, которая коррелируется с сильным снижением ferulate эфиры суберин и воски в клубни картофеля14. Одновременно в корни и семена Arabidopsis, нокаут своего предполагаемого orthologue (ASFT/RWP1) также продемонстрировал свою роль в производить алкиловые ferulates в суберин20,21. В картофеля линии репортер transcriptional FHT и антитела FHT показал соответственно что промоутер активность и белка расположены в exodermis, эндодермы, phellogen производные и раненых тканей15.
В этой работе мы подробно протокол с помощью A. rhizogenes для производства трансгенных волосатые корней, которые поддерживаются в дикого типа стрелять, генерации растений композитный картофеля или вырезан самостоятельно выращивать в пробирке. Мы также предоставляем протокол, используя A. tumefaciens для получения полного трансгенные картофель растений. В качестве тематического исследования а. rhizogenes и A. tumefaciens преобразована с же бинарный вектор используются для получения корни с FHT промоутер вождения ГАС репортер экспрессии генов. Результаты сообщили и сравнить.
Protocol
Representative Results
Discussion
В картофеля наиболее распространенной системой для получения стабильной полный трансгенных растений использует преобразование Agrobacterium tumefaciens штаммов, которые требуют органогенеза с помощью экзогенных фитогормонов. Хотя у Agrobacterium на основе протоколов имеет потенциал, чтобы …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Ministerio de Innovación y науки (AGL2009-13745, ИПИ Грант для PB), y Ministerio де Economía развитию и ФЕДЕР финансирования (AGL2012-36725, AGL2015-67495-C2-1-R) и Жиронского университета (доктор Грант SF, и Грант SING11/1). Авторы благодарны доктором Инге Broer (Институт землепользования, университета г. Росток, Росток, Германия) и доктор Salomé Прат (Centro Nacional де биотехнология, Мадрид, Испания) для обеспечения а. rhizogenes и A. tumefaciens деформации, соответственно и доктор Marçal Солер и д-р Анна Plasencia за помощь и поддержку, полученную в инициировании трансформации экспериментов A. rhizogenes (Университет Тулуза III Поль Сабатье — CNRS, завод лабораторных исследований (LRSV), Castanet Толозан, Франция). Авторы благодарят Сара Гомес (Кафедра де Biologia, UdG, Жирона) за ее ценную помощь в проведении лабораторных работ и забота о растений и Ferran Fontdecaba и Карла Санчес, который помогал с некоторыми из экспериментов, в то время как они делают свои окончательные дипломных проектов.
Materials
|
Acetone |
Panreac |
1.310.071.21 |
|
|
Acetosyringone |
Acros |
115540050 |
|
|
Aquarium pump |
Prodac |
MP350 |
|
|
Autoclave |
Ragpa Strelimatic |
||
|
Bacteriological agar |
Lab Conda |
1800 |
|
|
BAP |
Duchefa |
B0904 |
|
|
Beef extract |
Lab Conda |
1700 |
|
|
Plant growing cabinet |
Nuaire |
||
|
Carbenicillin |
Duchefa |
C0109 |
|
|
Cefotaxime sodium |
Duchefa |
C0111 |
|
|
DMSO |
Merck |
1029310161 |
|
|
Ecotron infors |
HT |
29378 |
|
|
Ethanol |
Merck |
1,009,831,011 |
|
|
Falcon tube |
Control tecnica |
CFT011500 |
|
|
Ferricyanate |
Sigma |
101001081 |
|
|
Ferrocyanate |
Sigma |
100979088 |
|
|
Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture |
Apiglass |
ref16 |
|
|
GA3 |
Sigma |
G7645 |
|
|
Gamborg B5 media |
Duchefa |
G0210 |
|
|
Gelrite |
Duchefa |
G1101 |
|
|
Glucosa |
Sigma |
G5767 |
|
|
Kanamycin |
Sigma |
K1377 |
|
|
Leukopor tape |
BSN Leukopor |
BDF47467 |
|
|
Lupe |
Wild-Heerbrugg |
M420 |
|
|
Magnetic shaker |
Agimatic |
7000243 |
|
|
MES hydrate |
Sigma |
M2933-25G |
|
|
MgSO4 |
Panreac |
131404 |
|
|
Microscope |
Olympus |
||
|
Minufugue centrifugue 5415R |
Eppendorf |
||
|
Murashige and Skoog media |
Duchefa |
M0254.0050 |
|
|
Na2HPO4 |
Panreac |
131679 |
|
|
NAA |
Duchefa |
N0903 |
|
|
NaCl |
Panreac |
131659 |
|
|
NaH2PO4 |
Sigma |
58282 |
|
|
NightSea Stereo |
SFA Moonting Adapter |
||
|
Parafilm |
Anorsa |
PRFL-001-001 |
|
|
Peptone |
Lab Conda |
1616 |
|
|
Petri dishes (90 x 14) |
Anorsa |
200200 |
|
|
pHmetre |
Crison |
||
|
Phytotron |
Inkoa |
RFTI-R5485 |
|
|
Plant Agar |
Duchefa |
P1001 |
|
|
Refrigeratot |
Liebherr Medline |
||
|
Rifampicin |
Duchefa |
R0146 |
|
|
Spectinomycin |
Sigma |
59007 |
|
|
Spectrophotometer |
Shimadzu |
||
|
Square plates (120 x 120) |
Deltalab |
200204 |
|
|
Streptomycin |
Sigma |
S6501 |
|
|
Sucrose |
Panreac |
131621 |
|
|
Surgical blades |
Swann-Morton |
201 |
|
|
Surgical needle |
NIPRO |
015/0204 |
|
|
Triptone |
Lab Conda |
1612 |
|
|
Triton |
Serva |
37240 |
|
|
Unimax 1010 shaker |
Heidolph |
||
|
Vacuum |
Dinko |
||
|
x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous) |
Biosynth |
B-7398 |
|
|
Yeast extract |
Lab Conda |
1702.00 |
|
|
Zeatin riboside |
Sigma |
1001042850 |
References
- Gelvin, S. B. Traversing the Cell: Agrobacterium T-DNA’s journey to the host genome. Frontiers in Plant Science. 3, 1-11 (2012).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 467-481 (2013).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).
- Ishida, Y., et al. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacteriumtumefaciens. Nature Biotechnology. 14 (6), 745-750 (1996).
- White, F. F., Taylor, B. H., Huffman, G. A., Gordon, M. P., Nester, E. W. Molecular and genetic analysis of the transferred DNA regions of the root-inducing plasmid of Agrobacterium rhizogenes. Journal of Bacteriology. 164 (1), 33-44 (1985).
- Dinh, P. T. Y., Brown, C. R., Elling, A. A. RNA Interference of effector gene Mc16D10L confers resistance against Meloidogyne chitwoodi in Arabidopsis and Potato. Phytopathology. 104 (10), 1098-1106 (2014).
- Horn, P., et al. Composite potato plants with transgenic roots on non-transgenic shoots: a model system for studying gene silencing in roots. Plant Cell Reports. 33 (12), 1977-1992 (2014).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2015).
- Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacteriumrhizogenes as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-469 (2014).
- Zhang, W., et al. Development and application of a universal and simplified multiplex RT-PCR assay to detect five potato viruses. Journal of General Plant Pathology. 83 (1), 33-45 (2017).
- Almasia, N. I., et al. Successful production of the potato antimicrobial peptide Snakin-1 in baculovirus-infected insect cells and development of specific antibodies. BMC Biotechnology. 17 (1), 1-11 (2017).
- Serra, O., et al. Silencing of StKCS6 in potato periderm leads to reduced chain lengths of suberin and wax compounds and increased peridermal transpiration. Journal of Experimental Botany. 60 (2), 697-707 (2009).
- Serra, O., et al. CYP86A33-Targeted gene silencing in potato tuber alters suberin composition, distorts suberin lamellae, and impairs the periderm’s water barrier function. Plant Physiology. 149 (2), 1050-1060 (2008).
- Serra, O., et al. A feruloyl transferase involved in the biosynthesis of suberin and suberin-associated wax is required for maturation and sealing properties of potato periderm. The Plant Journal. 62 (2), 277-290 (2010).
- Boher, P., Serra, O., Soler, M., Molinas, M., Figueras, M. The potato suberin feruloyl transferase FHT which accumulates in the phellogen is induced by wounding and regulated by abscisic and salicylic acids. Journal of Experimental Botany. 64 (11), 3225-3236 (2013).
- Serra, O., Chatterjee, S., Figueras, M., Molinas, M., Stark, R. E. Deconstructing a plant macromolecular assembly: chemical architecture, molecular flexibility, and mechanical performance of natural and engineered potato suberins. Biomacromolecules. 15 (3), 799-811 (2014).
- Vulavala, V. K. R., et al. Identification of genes related to skin development in potato. Plant Molecular Biology. 94 (4-5), 481-494 (2017).
- Landgraf, R., et al. The ABC transporter ABCG1 is required for suberin formation in potato tuber periderm. The Plant Cell. 26 (8), 3403-3415 (2014).
- Verdaguer, R., et al. Silencing of the potato StNAC103 gene enhances the accumulation of suberin polyester and associated wax in tuber skin. Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5415-5427 (2016).
- Molina, I., Li-Beisson, Y., Beisson, F., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. Identification of an Arabidopsis feruloyl-coenzyme A transferase required for suberin synthesis. Plant Physiology. 151 (3), 1317-1328 (2009).
- Gou, J. Y., Yu, X. -. H., Liu, C. J. A hydroxycinnamoyltransferase responsible for synthesizing suberin aromatics in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18855-18860 (2009).
- Banerjee, A. K., Prat, S., Hannapel, D. J. Efficient production of transgenic potato (S. tuberosum L. ssp. andigena) plants via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Plant Science. 170 (4), 732-738 (2006).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. a. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
- Schmidt, J. F., Moore, M. D., Pelcher, L. E., Covello, P. S. High efficiency Agrobacteriumrhizogenes-mediated transformation of Saponariavaccaria L. (Caryophyllaceae) using fluorescence selection. Plant Cell Reports. 26 (9), 1547-1554 (2007).
- Petti, C., Wendt, T., Meade, C., Mullins, E. Evidence of genotype dependency within Agrobacteriumtumefaciens in relation to the integration of vector backbone sequence in transgenic Phytophthorainfestans-tolerant potato. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 301-306 (2009).
- Gaudin, V., Vrain, T., Jouanin, L. Bacterial genes modifying hormonal balances in plants. Plant Physiology and Biochemistry. 32 (1), 11-29 (1994).
- Nemoto, K., et al. Function of the aux and rol genes of the Ri plasmid in plant cell division in vitro. Plant Signaling &. 행동분석학. 4 (12), 1145-1147 (2009).
- Visser, R. G. F., et al. Expression and inheritance of inserted markers in binary vector carrying Agrobacteriumrhizogenes-transformed potato (Solanumtuberosum L.). Theoretical and Applied Genetics. 78 (5), 705-714 (1989).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Pati, P. K., Rideau, M., Gantet, P. Hairy root research: recent scenario and exciting prospects. Current Opinion in Plant Biology. 9 (3), 341-346 (2006).
- Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-Müller, J., Xu, J. Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource. Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).
- Ooms, G., Lenton, J. R. T-DNA genes to study plant development: precocious tuberisation and enhanced cytokinins in A. tumefaciens transformed potato. Plant Molecular Biology. 5 (4), 205-212 (1985).
- de Vries-Uijtewaal, E., et al. Fate of introduced genetic markers in transformed root clones and regenerated plants of monohaploid and diploid potato genotypes. TAG. Theoretical and applied genetics. 78 (2), 185-193 (1989).
- Bird, D., et al. Characterization of Arabidopsis ABCG11/WBC11, an ATP binding cassette (ABC) transporter that is required for cuticular lipid secretion. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 52 (3), 485-498 (2007).
- Luo, B., Xue, X. Y., Hu, W. L., Wang, L. J., Chen, X. Y. An ABC transporter gene of Arabidopsis thaliana, AtWBC11, is involved in cuticle development and prevention of organ fusion. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1780-1802 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DESPERADO/AtWBC11 transporter is required for cutin and wax secretion. Plant Physiology. 145 (4), 1345-1360 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DSO/ABCG11 transporter affects cutin metabolism in reproductive organs and suberin in roots. Molecular Plant. 3 (3), 563-575 (2010).
- Bjelica, A., et al. Fatty acid ω-hydroxylases from Solanum tuberosum. Plant Cell Reports. 35 (12), 2435-2448 (2016).
- Ding, Y., et al. Abscisic acid coordinates nod factor and cytokinin signaling during the regulation of nodulation in Medicago truncatula. The Plant Cell. 20 (10), 2681-2695 (2008).
- Isayenkov, S., Mrosk, C., Stenzel, I., Strack, D., Hause, B. Suppression of allene oxide cyclase in hairy roots of Medicagotruncatula reduces jasmonate levels and the degree of mycorrhization with glomus intraradices 1[w]. Plant Physiology. 139 (3), 1401-1410 (2005).
- Dalton, D. A., et al. Physiological roles of glutathione S-Transferases in soybean root Nodules 1[C][W][OA]. Plant Physiology. 150 (1), 521-530 (2009).
- Limpens, E., et al. RNA interference in Agrobacteriumrhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula. Journal of Experimental Botany. 55 (399), 983-992 (2004).
