ATAC-seq Assay met lage mitochondriaal DNA besmetting van primaire menselijke CD4 + T lymfocyten

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van een test voor transposase-toegankelijk chromatine sequencing (ATAC-seq) op de geactiveerde CD4 + menselijke lymfocyten. Het protocol is aangepast om het minimaliseren van verontreiniging van het mitochondriaal DNA leest van 50% tot 3% via de invoering van een nieuwe lysis-buffermengsel.

Abstract

ATAC-seq is uitgegroeid tot een veel gebruikte methodiek in de studie van de epigenetica vanwege zijn snelle en eenvoudige benadering van genoom-brede toegankelijk chromatine in kaart te brengen. In deze paper presenteren we een verbeterde ATAC-seq-protocol, dat vermindert de verontreiniging van het mitochondriaal DNA leest. Terwijl vorige ATAC-seq protocollen hebben geworsteld met leest een gemiddelde van 50% besmetten mitochondriaal DNA, de geoptimaliseerde lysis-buffermengsel in dit protocol opgenomen vermindert mitochondriaal DNA besmetting tot een gemiddelde van 3%. Dit verbeterde ATAC-seq-protocol voorziet in een in de omgeving van 50% vermindering van de kosten van het rangschikken. We laten zien hoe deze kwalitatief hoogwaardige ATAC-seq bibliotheken kunnen bereid worden uit geactiveerde CD4 +-lymfocyten, stapsgewijze instructies uit CD4 + lymfocyt isolement van volbloed door middel van data-analyse. Dit verbeterde ATAC-seq-protocol in een breed scala van celtypes is gevalideerd en zullen voor onmiddellijk gebruik aan onderzoekers bestuderen van chromatine toegankelijkheid.

Introduction

De assay voor transposase-toegankelijk chromatine sequencing (ATAC-seq) is snel uitgegroeid tot de toonaangevende methode voor de raadpleging van de chromatine het platform. ATAC-seq herkent regio’s van de toegankelijke chromatine door het proces van tagmentation, fragmenteren en tagging van DNA door het zelfde enzym, voor de productie van bibliotheken waarmee reeksnummers chromatine toegankelijkheid over een gehele genoom kunt bepalen. Dit tagmentation proces wordt gemedieerd door de hyperactieve Tn5 transposase, die alleen open regio’s van de chromatine als gevolg van nucleosomic sterische hinder snijdt. Als het snijdt, voegt de transposase van de Tn5 ook sequencing adapters waarmee voor snelle bibliotheek bouw door PCR en volgende-generatie sequentiebepaling van het genoom-brede toegankelijk chromatine^1,2.

ATAC-seq is uitgegroeid tot de geprefereerde methode om te bepalen van de regio’s van de chromatine toegankelijkheid als gevolg van de relatief eenvoudige en snelle protocol, de kwaliteit en de hoeveelheid informatie die kan worden bepaald uit de resultaten, en de kleine hoeveelheid grondstof nodig. Vergeleken met DNase-seq³ (die ook maatregelen genoom-brede chromatine toegankelijkheid), MNase-seq⁴ (die bepaalt nucleosoom posities open genoom regio), en de formaldehyde-gemedieerde FAIRE-seq⁵, ATAC-seq is sneller, goedkoper en meer reproduceerbare¹. Het is ook meer gevoelig, werken met de grondstof voor zo weinig als 500 kernen, ten opzichte van de kernen van de 50 miljoen nodig voor DNase-seq³. ATAC-seq heeft ook de mogelijkheid om meer informatie over de architectuur van de chromatine dan andere methoden, met inbegrip van de regio’s van transcriptie factor bindende, nucleosoom positionering en open chromatine regio’s¹. Effectieve, eencellige ATAC-seq-protocollen zijn gevalideerd, voorlichting over chromatine architectuur aan de eencellige niveau^6,–⁷.

ATAC-seq is gebruikt voor het karakteriseren van chromatine het platform over een breed spectrum van onderzoek en cellen soorten, met inbegrip van planten⁸, mens⁹en vele andere organismen. Het is ook cruciaal voor het identificeren van Epigenetische regulatie van de ziekte staten⁷geweest. Het meest gebruikte ATAC-seq-protocol bevat echter het grote nadeel van besmetting sequencing leesbewerkingen van mitochondriaal DNA. In sommige datasets kunnen dit niveau van verontreiniging oplopen tot 60% van de volgorde van de resultaten¹. Er is een gezamenlijke inspanning op het gebied om deze contaminerende mitochondriale leest zodat de meer efficiënte toepassing van ATAC-seq^7,10,11. Hier presenteren we een verbeterde ATAC-seq-protocol dat het mitochondriaal DNA verontreiniging tarief reduceert tot slechts 3%, waardoor vermindering van ongeveer 50% in sequencing kosten¹⁰. Dit wordt mogelijk gemaakt door een gestroomlijnd proces van activering, CD4 +-lymfocyten isolatie en een verbeterde lysis-buffermengsel die van essentieel belang bij het minimaliseren van mitochondriaal DNA besmetting.

Dit protocol modifiedATAC-seq is gevalideerd met een breed scala van primaire cellen, met inbegrip van de primaire perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs)¹⁰, menselijke primaire monocyten en muis dendritische cellen (niet uitgegeven). Het is ook gebruikt met succes om te ondervragen melanoom cellijnen in een geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) scherm met niet-coderende elementen¹¹. Daarnaast biedt het gegevenspakket analyse in dit protocol omschreven en aangeboden op GitHub nieuwe en ervaren onderzoekers met tools om ATAC-seq gegevens te analyseren. ATAC-seq is de meest effectieve assay chromatine toegankelijkheid over een gehele genoom in kaart, en wijzigingen in het bestaande protocol die hier worden geïntroduceerd onderzoekers om kwalitatief hoogwaardige gegevens met lage mitochondriaal DNA besmetting, te produceren zal toestaan sequencing kostenverlaging en het verbeteren van ATAC-seq doorvoer.

Protocol

Dit verbeterde protocol bevat stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van ATAC-seq van CD4 +-lymfocyten, van de grondstof van volbloed door middel van data-analyse (Figuur 1). 1. isolatie van CD4 + T cellen van volbloed Opmerking: De grondstof voor dit protocol is 15 mL vers volledig bloed verzameld met behulp van standaardprocedures, zodat de bron van de grondstoffen worden geselecteerd op basis van onderzoek vereist…

Representative Results

Van 15 mL vers volledig bloed genereert dit protocol een gemiddelde van 1 miljoen CD4 + T cellen. Dit kunnen worden ingevroren voor later te worden verwerkt of gebruikt onmiddellijk. Levensvatbaarheid van de CD4 + T-cellen, verse of ontdooide, was consequent > 95%. Deze methode van CD4 + T cel isolatie zorgt voor flexibiliteit in de bron-materiaal en collectie-tijd. Dit verbeterde ATAC-seq-protocol produceert een definitieve bibliotheek van meer dan 1 ng/µL voor het rangschikken. Kwalite…

Discussion

Het gewijzigde ATAC-seq-protocol gepresenteerd in dit artikel biedt reproduceerbare resultaten met minimale mitochondriaal DNA-besmetting. Het protocol is met succes gebruikt om zijn karakteriseren chromatine architectuur van menselijke primaire PBMCs¹⁰, menselijke monocyten, muis dendritische cellen (ongepubliceerd), en gekweekte melanoom cel lijnen¹¹. Wij verwachten dat deze verbeterde lysis voorwaarde heeft het potentieel om te werken voor andere celtypes ook. Verwacht w…

Materials

1X PBS, Sterile	Gibco	10010023	Can use other comparable products.
5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets	Eppendorf	22625501	Can use other comparable products.
96 Well Round Bottom Plate	Thermo Scientific	163320	Can use other comparable products.
Agilent 4200 Tape Station System	Agilent	G2991AA	Suggested for quality assessment.
Cryotubes	Thermo Scientific	374081	Can use other comparable products.
DMSO	Sigma	D8418	Can use other comparable products.
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Invitrogen Life Technologies	11131D	Critical Component
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit	Invitrogen Life Technologies	11346D	Critical Component
Dynamagnet	Invitrogen Life Technologies	12321D	Critical Component
FCS	Gemini Bio Products	100-500	Can use other comparable products.
High Sensitivity DNA Kit	Agilent	50674626	Suggested for quality assessment.
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade	Sigma	M2393	Can use other comparable products.
MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)	Qiagen	28004	Critical Component
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Can use other comparable products.
NaCl, Molecular Biology Grade	Sigma	S3014	Can use other comparable products.
NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix	New England BioLabs	M0541	Critical Component
Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme)	Illumina	FC1211030	Critical Component
Nuclease Free Sterile dH20	Gibco	10977015	Can use other comparable products.
Polysorbate 20 (Tween20)	Sigma	P9416	Can use other comparable products.
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A25780	Critical Component
Precision Water Bath	Thermo Scientific	TSGP02	Can use other comparable products.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	Critical Component
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen Life Technologies	Q32851	Suggested for quality assessment.
Qubit FlouroMeter	Invitrogen Life Technologies	Q33226	Suggested for quality assessment.
Rosette Sep Human CD4+ Density Medium	Stem Cell Technologies	15705	Critical Component
Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail	Stem Cell Technologies	15022	Critical Component
RPMI-1640	Gibco	11875093	Can use other comparable products.
Sterile Resevoir	Thermo Scientific	8096-11	Can use other comparable products.
T100 Thermocycler with Heated Lid	BioRad	1861096	Can use other comparable products.
Tris-HCL	Sigma	T5941	Can use other comparable products.