ATAC-seq analisi con DNA mitocondriale bassa contaminazione da primaria umana CD4 + linfociti T

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un test per transposase-accessibile della cromatina (ATAC-seq) la sequenziazione su linfociti CD4 + umani. Il protocollo è stato modificato per ridurre al minimo la contaminazione letture di DNA mitocondriale dal 50% al 3% attraverso l’introduzione di un nuovo buffer di lisi.

Abstract

ATAC-seq è diventata una metodologia ampiamente usata nello studio dell’epigenetica a causa del suo approccio rapido e semplice alla mappatura del genoma accessibile della cromatina. In questa carta presentiamo un protocollo ATAC-seq migliorato che riduce la contaminazione letture di DNA mitocondriale. Mentre precedente ATAC-seq protocolli hanno lottato con una media di 50% contaminando il DNA mitocondriale si legge, il buffer di lisi ottimizzato introdotto in questo protocollo riduce la contaminazione di DNA mitocondriale a una media del 3%. Questo protocollo di ATAC-seq migliorata consente una riduzione del 50% nei pressi del costo di sequenziamento. Dimostriamo come queste librerie di ATAC-seq di alta qualità possono essere preparate da linfociti CD4 + attivati, fornendo istruzioni dettagliate da CD4 + isolamento dei linfociti da sangue intero attraverso l’analisi dei dati. Questo protocollo di ATAC-seq migliorata è stata convalidata in una vasta gamma di tipi di cellule e sarà di immediata utilità per i ricercatori che studiano l’accessibilità della cromatina.

Introduction

Il dosaggio per transposase-accessibile della cromatina sequenziamento (ATAC-seq) è rapidamente diventato il principale metodo per interrogare architettura della cromatina. ATAC-seq può identificare regioni di cromatina accessibile attraverso il processo di tagmentation, la frammentazione e la codifica di DNA con lo stesso enzima, per produrre le librerie con cui sequenziamento può determinare l’accessibilità cromatinica attraverso un intero genoma. Questo processo di tagmentation è mediato dalla transposase Tn5 iperattivo, che taglia solo regioni aperte della cromatina a causa di composti sterico. Come taglia, la transposase Tn5 inserisce anche schede di sequenziamento che consentono la costruzione della libreria rapida mediante PCR e sequenziamento di nuova generazione di cromatina accessibile genoma^1,2.

ATAC-seq è diventato il metodo preferito per determinare aree di accessibilità della cromatina a causa del protocollo relativamente semplice e veloce, la qualità e la gamma di informazioni che possono essere determinati dai suoi risultati e la piccola quantità di materiale necessario di partenza. Rispetto a dnasi-seq³ (che misura anche l’accessibilità della cromatina genoma), MNase-seq⁴ (che determina posizioni nucleosoma nelle regioni del genoma aperto), e la formaldeide-mediata FAIRE-seq⁵, ATAC-seq è più veloce, più economico e più riproducibili¹. È anche più sensibile, lavorando con materiale di minor come 500 nuclei, rispetto ai 50 milioni nuclei richiesti per dnasi-seq³di partenza. ATAC-seq ha anche la capacità di fornire ulteriori informazioni sull’architettura di cromatina rispetto ad altri metodi, comprese le regioni di legame del fattore di trascrizione, nucleosoma posizionamento e cromatina aperta regioni¹. Efficace, unicellulare ATAC-seq protocolli sono stati convalidati, fornendo informazioni sull’architettura della cromatina al livello unicellulare^6,7.

ATAC-seq è stato utilizzato per caratterizzare l’architettura della cromatina attraverso un ampio spettro di tipi di ricerca e cellule, tra cui piante⁸, esseri umani⁹e molti altri organismi. E ‘ stato anche critico nell’identificazione di regolazione epigenetica di malattia stati⁷. Tuttavia, il protocollo più diffuso di ATAC-seq include il grave inconveniente di letture di sequenziamento di contaminazione da DNA mitocondriale. In alcuni set di dati, questo livello di contaminazione può essere alto come il 60% di sequenziamento risultati¹. C’è uno sforzo concertato nel campo per ridurre queste letture mitocondriale contaminanti al fine di consentire l’applicazione più efficiente di ATAC-seq^7,10,11. Qui presentiamo un protocollo ATAC-seq migliorato che riduce il tasso di contaminazione di DNA mitocondriale ad appena il 3%, permettendo la riduzione del 50% circa nel sequenziamento costi¹⁰. Ciò è reso possibile da un processo semplificato di isolamento di linfociti CD4 + e l’attivazione e un buffer di lisi migliorata che è fondamentale per minimizzare la contaminazione del DNA mitocondriale.

Questo protocollo modifiedATAC-seq è stato convalidato con una vasta gamma di cellule primarie, tra cui primario del sangue periferico umano cellule mononucleari (PBMCs)¹⁰, monociti umani primari e le cellule dendritiche (inedite) del mouse. È anche stato utilizzato con successo per interrogare le linee cellulari di melanoma in uno schermo regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR) cluster di non-codificazione elements¹¹. Inoltre, il pacchetto di analisi dei dati descritto in questo protocollo e forniti su GitHub fornisce ai ricercatori nuovi ed esperti con strumenti per analizzare i dati ATAC-seq. ATAC-seq è il dosaggio più efficace per eseguire il mapping all’accessibilità cromatinica attraverso un intero genoma, e modifiche al protocollo esistente che vengono introdotti qui permetterà ai ricercatori di produrre dati di alta qualità con bassa contaminazione di DNA mitocondriale, riducendo i costi di sequenziamento e migliorando la velocità di ATAC-seq.

Protocol

Questo protocollo migliorato fornisce istruzioni dettagliate per eseguire ATAC-seq di linfociti CD4 +, da materiale di partenza di sangue intero attraverso l’analisi dei dati (Figura 1). 1. isolamento di CD4 + cellule di T dal sangue intero Nota: Il materiale di partenza per questo protocollo è 15 mL di sangue intero fresco raccolti utilizzando le procedure standard, permettendo l’origine della materia prima di essere se…

Representative Results

A partire da 15 mL di sangue intero fresco, questo protocollo genera una media di 1 milione di cellule T CD4 +. Questi possono essere congelati per la successiva elaborazione o utilizzati immediatamente. Vitalità delle cellule T CD4 +, fresche o scongelate, era costantemente > 95%. Questo metodo di isolamento delle cellule T CD4 + consente flessibilità nel tempo di materiale e raccolta di origine. Questo protocollo di ATAC-seq migliorato produce una raccolta finale di più maggior di 1 …

Discussion

Il protocollo modificato di ATAC-seq presentato in questo articolo fornisce risultati riproducibili con contaminazione minima di DNA mitocondriale. Il protocollo è stato usato per con successo caratterizzano l’architettura della cromatina di umano primario PBMCs¹⁰, monociti umani, le cellule dendritiche (inedite) del mouse, e linee cellulari di melanoma coltivate¹¹. Anticipiamo la lisi migliorata condizione ha il potenziale di lavorare per altri tipi di cellule pure. È an…

Materials

1X PBS, Sterile	Gibco	10010023	Can use other comparable products.
5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets	Eppendorf	22625501	Can use other comparable products.
96 Well Round Bottom Plate	Thermo Scientific	163320	Can use other comparable products.
Agilent 4200 Tape Station System	Agilent	G2991AA	Suggested for quality assessment.
Cryotubes	Thermo Scientific	374081	Can use other comparable products.
DMSO	Sigma	D8418	Can use other comparable products.
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Invitrogen Life Technologies	11131D	Critical Component
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit	Invitrogen Life Technologies	11346D	Critical Component
Dynamagnet	Invitrogen Life Technologies	12321D	Critical Component
FCS	Gemini Bio Products	100-500	Can use other comparable products.
High Sensitivity DNA Kit	Agilent	50674626	Suggested for quality assessment.
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade	Sigma	M2393	Can use other comparable products.
MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)	Qiagen	28004	Critical Component
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Can use other comparable products.
NaCl, Molecular Biology Grade	Sigma	S3014	Can use other comparable products.
NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix	New England BioLabs	M0541	Critical Component
Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme)	Illumina	FC1211030	Critical Component
Nuclease Free Sterile dH20	Gibco	10977015	Can use other comparable products.
Polysorbate 20 (Tween20)	Sigma	P9416	Can use other comparable products.
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A25780	Critical Component
Precision Water Bath	Thermo Scientific	TSGP02	Can use other comparable products.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	Critical Component
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen Life Technologies	Q32851	Suggested for quality assessment.
Qubit FlouroMeter	Invitrogen Life Technologies	Q33226	Suggested for quality assessment.
Rosette Sep Human CD4+ Density Medium	Stem Cell Technologies	15705	Critical Component
Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail	Stem Cell Technologies	15022	Critical Component
RPMI-1640	Gibco	11875093	Can use other comparable products.
Sterile Resevoir	Thermo Scientific	8096-11	Can use other comparable products.
T100 Thermocycler with Heated Lid	BioRad	1861096	Can use other comparable products.
Tris-HCL	Sigma	T5941	Can use other comparable products.