أتاك-seq المقايسة مع الحمض النووي منخفضة التلوث من الابتدائي البشرية CD4 + تي الخلايا اللمفية

Summary

نقدم هنا، وضع بروتوكول لتنفيذ مقايسة الكروماتين ترانسبوساسي موجوداً التسلسل (أتاك-seq) على تنشيط اللمفاويات CD4 + البشرية. لقد تم تعديل البروتوكول للتقليل من تلوث الميتوكوندريا الحمض النووي ما يلي: من 50% إلى 3% من خلال إدخال مخزن مؤقت تحلل الجديدة.

Abstract

وأصبح أتاك-seq منهجية مستخدمة على نطاق واسع في دراسة التخلق بسبب نهجها سريعة وبسيطة لرسم خرائط الجينوم المنظومة الكروماتين موجوداً. في هذه الورقة نقدم بروتوكولا أتاك-seq محسنة تقلل تلوث الميتوكوندريا الحمض النووي ما يلي:. بينما ناضلت البروتوكولات أتاك-seq السابقة مع يقرأ بمعدل 50% تلويث الحمض النووي، تحلل الأمثل المخزن المؤقت في هذا البروتوكول يقلل من تلوث الحمض النووي mitochondrial إلى متوسط 3%. يسمح هذا البروتوكول أتاك-seq محسنة لتخفيض تكلفة التسلسل قريب 50%. ونحن تثبت كيف يمكن إعداد هذه المكتبات أتاك-seq عالية الجودة من تنشيط خلايا CD4 + الخلايا الليمفاوية، توفير إرشادات خطوة بخطوة من اللمفاويات عزل خلايا CD4 + من الدم كله من خلال تحليل البيانات. هذا البروتوكول أتاك-seq تحسين قد تم التحقق من صحتها في طائفة واسعة من أنواع الخلايا، وسوف يكون للاستخدام الفوري للباحثين الذين يدرسون إمكانية الكروماتين.

Introduction

سرعان ما أصبحت المقايسة الكروماتين ترانسبوساسي موجوداً التسلسل (أتاك-seq) الأسلوب الرائد لاستجواب العمارة الكروماتين. أتاك-seq يمكن تحديد مناطق الكروماتين موجوداً من خلال عملية تاجمينتيشن، وتفتيت ووضع علامات على الحمض النووي من الإنزيم نفسه، لإنتاج المكتبات التي يمكن تحديد تسلسل الكروماتين إمكانية الوصول عبر جينوم أكمله. هو توسط هذه العملية تاجمينتاتيون ترانسبوساسي Tn5 مفرط، مما يقطع فقط فتح مناطق الكروماتين بسبب عائق الفراغية نوكليوسوميك. كما أنه يخفض، ترانسبوساسي Tn5 أيضا بإدراج تسلسل المحولات التي تسمح ببناء مكتبة السريع ببكر وتسلسل الجيل القادم من الكروماتين موجوداً على نطاق الجينوم^1،2.

وقد أصبح أتاك-seq الأسلوب المفضل لتحديد مناطق الكروماتين إمكانية الوصول إلى سبب بروتوكول بسيط وسريع نسبيا، ونوعية ونطاق المعلومات التي يمكن تحديدها من نتائجها، وكمية صغيرة من ابتداء من المواد المطلوبة. مقابل seq الدناز³ (الذي يقيس أيضا إمكانية الحصول على نطاق الجينوم الكروماتين)، seq منسى⁴ (الذي يحدد مواقف نوكليوسومي في المناطق المفتوحة الجينوم)، وفورمالدهايد بوساطة فير-seq⁵، أتاك-seq أسرع، أرخص وأكثر استنساخه¹. كما أنها أكثر حساسية، العمل مع ابتداء من المواد لعدد قليل من نويات 500، بالمقارنة مع الأنوية 50 مليون المطلوب ل seq الدناز³. وقد أتاك-seq أيضا القدرة على تقديم مزيد من المعلومات حول بنية الكروماتين من الأساليب الأخرى، بما في ذلك مناطق ملزمة عامل النسخ، نوكليوسومي لتحديد المواقع، و مناطق الكروماتين المفتوحة¹. تم التحقق من بروتوكولات seq أتاك الفعال، خلية واحدة، تقديم معلومات عن العمارة الكروماتين في خلية واحدة المستوى^6،7.

وقد استخدمت أتاك-seq لتوصيف العمارة الكروماتين عبر طائفة واسعة من أنواع البحوث والخلايا، بما في ذلك النباتات⁸،⁹من البشر، والعديد من الكائنات الحية الأخرى. كما كان حاسما في تحديد لائحة جينية للمرض الدول⁷. ومع ذلك، يشمل البروتوكول أتاك-seq الأكثر استخداماً العيب الرئيسي التلوث قراءة تسلسل الحمض النووي. في بعض مجموعات البيانات، ويمكن أن يكون هذا مستوى التلوث تصل إلى 60 في المائة من تسلسل النتائج¹. وهناك جهد متضافر في الحقل لتقليل هذه القراءات المتقدرية تلويث بغية السماح للتطبيق أكثر كفاءة من أتاك-seq^7،،من¹⁰¹¹. هنا نقدم بروتوكولا أتاك-seq محسنة يقلل من معدل التلوث الحمض النووي mitochondrial إلى 3 في المائة فقط، مما يتيح الحد من حوالي 50% في تسلسل تكاليف¹⁰. أصبح هذا ممكناً من خلال عملية مبسطة اللمفاويات عزل خلايا CD4 + والتنشيط ومؤقت تحلل تحسن مهم في التقليل من تلوث الحمض النووي mitochondrial.

وقد تم التحقق من صحة هذا البروتوكول seq موديفيداتاك مع مجموعة واسعة نطاق من الخلايا الابتدائية، بما فيها البشرية الدم المحيطي الابتدائي الخلايا وحيدات النوى (ببمكس)¹⁰ووحيدات الأساسية البشرية والخلايا الجذعية الماوس (غير منشور). فقد استخدمت أيضا بنجاح استجواب خطوط خلايا سرطان الجلد في شاشة يكرر المتناوب قصير إينتيرسباسيد بانتظام (كريسبر) متفاوت المسافات من العناصر غير الترميز¹¹. بالإضافة إلى ذلك، توفر الحزمة تحليل البيانات المبينة في هذا البروتوكول، وقدمت في GitHub الباحثين الجدد وذوي الخبرة مع أدوات لتحليل البيانات أتاك-seq. أتاك-seq هو التحليل الأكثر فعالية لتعيين الكروماتين إمكانية الوصول عبر جينوم أكمله والتعديلات على البروتوكول القائمة التي يتم إدخالها هنا ستسمح للباحثين لإنتاج بيانات عالية الجودة مع انخفاض التلوث الحمض النووي mitochondrial، تخفيض تكاليف التسلسل وتحسين الإنتاجية أتاك-seq.

Protocol

يوفر هذا البروتوكول تحسين الإرشادات خطوة بخطوة لأداء أتاك-seq لخلايا CD4 + الخلايا الليمفاوية، من المواد بدءاً من الدم كله من خلال تحليل البيانات (الشكل 1). 1-عزل خلايا CD4 + تي الخلايا من الدم كله ملاحظة: انطلاق المواد لهذا البروتوكول 15 مل دم…

Representative Results

من 15 مل دم كله جديدة، ينشئ هذا البروتوكول في وسط خلايا CD4 + “تي” 1 مليون. وهذه يمكن المجمدة للمعالجة فيما بعد أو استخدامها على الفور. الجدوى لخلايا CD4 + T، طازجة أو المذابة، كان دائماً > 95%. يسمح هذا الأسلوب لعزل خلايا CD4 + T للمرونة في الوقت مصدر المواد وجمع. وتنتج هذا البروتوكول أ…

Discussion

ينص البروتوكول أتاك-seq المعدلة المقدمة في هذه المقالة النتائج استنساخه مع الحد الأدنى من التلوث الحمض النووي mitochondrial. البروتوكول قد المستخدمة لنجاح تميز الكروماتين العمارة البشرية الأولية ببمكس¹⁰، وحيدات البشرية، والخلايا الجذعية الماوس (غير منشور)، وخطوط الخلية الميلانوما …

Materials

1X PBS, Sterile	Gibco	10010023	Can use other comparable products.
5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets	Eppendorf	22625501	Can use other comparable products.
96 Well Round Bottom Plate	Thermo Scientific	163320	Can use other comparable products.
Agilent 4200 Tape Station System	Agilent	G2991AA	Suggested for quality assessment.
Cryotubes	Thermo Scientific	374081	Can use other comparable products.
DMSO	Sigma	D8418	Can use other comparable products.
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Invitrogen Life Technologies	11131D	Critical Component
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit	Invitrogen Life Technologies	11346D	Critical Component
Dynamagnet	Invitrogen Life Technologies	12321D	Critical Component
FCS	Gemini Bio Products	100-500	Can use other comparable products.
High Sensitivity DNA Kit	Agilent	50674626	Suggested for quality assessment.
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade	Sigma	M2393	Can use other comparable products.
MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)	Qiagen	28004	Critical Component
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Can use other comparable products.
NaCl, Molecular Biology Grade	Sigma	S3014	Can use other comparable products.
NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix	New England BioLabs	M0541	Critical Component
Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme)	Illumina	FC1211030	Critical Component
Nuclease Free Sterile dH20	Gibco	10977015	Can use other comparable products.
Polysorbate 20 (Tween20)	Sigma	P9416	Can use other comparable products.
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A25780	Critical Component
Precision Water Bath	Thermo Scientific	TSGP02	Can use other comparable products.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	Critical Component
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen Life Technologies	Q32851	Suggested for quality assessment.
Qubit FlouroMeter	Invitrogen Life Technologies	Q33226	Suggested for quality assessment.
Rosette Sep Human CD4+ Density Medium	Stem Cell Technologies	15705	Critical Component
Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail	Stem Cell Technologies	15022	Critical Component
RPMI-1640	Gibco	11875093	Can use other comparable products.
Sterile Resevoir	Thermo Scientific	8096-11	Can use other comparable products.
T100 Thermocycler with Heated Lid	BioRad	1861096	Can use other comparable products.
Tris-HCL	Sigma	T5941	Can use other comparable products.