ATAC-seq Assay med lav mitokondriel DNA forurening fra primære menneskelige CD4 + T-lymfocytter

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at udføre en analyse for transposase-tilgængelige kromatin sekventering (ATAC-seq) på aktiverede CD4 + humane lymfocytter. Protokollen er blevet ændret for at minimere kontaminering af mitokondriel DNA læsninger fra 50% til 3% gennem indførelse af en ny lysisbuffer.

Abstract

ATAC-seq er blevet en meget anvendt metode i studiet af Epigenetik på grund af sin hurtige og enkle tilgang til kortlægning genome-wide tilgængelige kromatin. I dette papir præsenterer vi en forbedret ATAC-seq-protokol, der reducerer forurener mitokondriel DNA læser. Mens tidligere ATAC-seq protokoller har kæmpet med læser et gennemsnit på 50% forurener mitokondrie-DNA, den optimerede lysisbuffer indført i denne protokol reducerer mitokondriel DNA forurening til et gennemsnit på 3%. Denne forbedrede ATAC-seq protokol giver mulighed for en i nærheden af 50% reduktion i sekventering omkostninger. Vi demonstrere, hvordan disse høj kvalitet ATAC-seq biblioteker kan fremstilles af aktiverede CD4 + lymfocytter, giver trinvise instruktioner fra CD4 + lymfocyt isolation fra fuldblod gennem analyse af data. Denne forbedrede ATAC-seq protokol er blevet valideret i en lang række celletyper og vil være til umiddelbar nytte for forskere studerer kromatin tilgængelighed.

Introduction

Assay for transposase-tilgængelige kromatin sekventering (ATAC-FF.) er hurtigt blevet den førende metode til spørgekriterierne kromatin arkitektur. ATAC-seq kan identificere regioner af tilgængelige kromatin gennem processen med tagmentation, fragmentering og mærkning af DNA af det samme enzym til fremstilling af biblioteker som sekvensering kan bestemme kromatin tilgængelighed på tværs af en hel genom. Denne tagmentation proces er medieret af en hyperaktiv Tn5 transposase, som kun skærer åbne områder af kromatin på grund af nucleosomic sterisk hindring. Som det skærer, indsætter Tn5 transposase også sekventering adaptere, der giver mulighed for hurtig bibliotek opbygning af PCR og næste generation sequencing genome-wide tilgængelige kromatin^1,2.

ATAC-seq er blevet den foretrukne metode til at bestemme regioner af kromatin tilgængelighed på grund af relativt enkel og hurtig protokol, kvalitet og udvalg af oplysninger, der kan bestemmes ud fra dens resultater, og lille mængde starter materiale kræves. I forhold til DNase-seq³ (som også måler genome-wide kromatin tilgængelighed), MNase-seq⁴ (som bestemmer nucleosome positioner i åben genom regioner), og at formaldehyd-medieret FAIRE-seq⁵, ATAC-seq er hurtigere, billigere og mere reproducerbare¹. Det er også mere følsomme, arbejder med begyndende materiale af så få som 500 kerner, i forhold til de 50 millioner kerner kræves for DNase-FF.³. ATAC-seq har også evnen til at give flere oplysninger om kromatin arkitektur end andre metoder, herunder regionerne transskription faktor bindende, nucleosome placering og åbne kromatin regioner¹. Effektiv, encellede ATAC-seq protokoller er blevet valideret, med oplysninger om kromatin arkitektur på én celle niveau^6,7.

ATAC-seq er blevet brugt til at karakterisere kromatin arkitektur på tværs af et bredt spektrum af typer af forskning og celler, herunder planter⁸, mennesker⁹og mange andre organismer. Det har også været kritisk at identificere epigenetisk regulering af sygdom stater⁷. Den mest udbredte ATAC-seq protokol indeholder dog den store ulempe ved forurening sekventering læsninger fra mitokondrie-DNA. I nogle datasæt, kan denne forurening niveau være så høj som 60% af sekventering resultater¹. Der er en samordnet indsats i feltet for at reducere disse kontaminerende mitokondrie læser for at muliggøre en mere effektiv anvendelse af ATAC-FF.^7,10,11. Her præsenterer vi en forbedret ATAC-seq-protokol, der reducerer den mitokondrielle DNA forurening sats til kun 3%, så reduktion på omkring 50% i sekventering omkostninger¹⁰. Dette er gjort muligt af en strømlinet proces af CD4 + lymfocyt isolation og aktivering og en forbedret lysisbuffer, der er kritisk i at minimere mitokondriel DNA forurening.

Denne modifiedATAC-seq protokol er blevet valideret med en bred vifte af primærelementer, herunder menneskelige primære perifert blod mononukleære celler (PBMC)¹⁰, menneskelig primær monocytter og mus dendritiske celler (upubliceret). Det har også været anvendt med succes til at afhøre melanom cellelinjer i et klyngemiljø regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) skærm af ikke-kodende elementer¹¹. Derudover giver analyse datapakke beskrevet i denne protokol og leveres på GitHub nye og erfarne forskere med værktøjer til at analysere ATAC-seq data. ATAC-seq er den mest effektive assay at kortlægge kromatin tilgængelighed på tværs af en hel genom, og ændringer i den eksisterende protokol, der er indført her giver forskere til at producere data af høj kvalitet med lav mitokondriel DNA forurening, at reducere sekventering omkostninger og forbedre ATAC-seq overførselshastighed.

Protocol

Denne forbedrede protokol indeholder trinvise instruktioner til at udføre ATAC-seq af CD4 + lymfocytter, fra råvare fuldblod gennem analyse af data (figur 1). 1. isolering af CD4 + T-celler fra fuldblod Bemærk: Råvaren til denne protokol er 15 mL frisk fuldblod indsamlet ved hjælp af standard procedurer, så kilde af råvaren skal vælges baseret på forskningsbehov. Skalere protokollen efter behov. Pre varm phosphat…

Representative Results

Fra 15 mL frisk fuldblod genererer denne protokol et gennemsnit på 1 million CD4 + T-celler. Disse kan nedfryses til senere behandling eller anvendes straks. Levedygtighed af CD4 + T-celler, friske eller optøede, var konsekvent > 95%. Denne metode af CD4 + T celle isolation giver mulighed for fleksibilitet i kilde materiale og samling tid. Denne forbedrede ATAC-seq protokol producerer en endelige bibliotek på mere end 1 ng/µL til sekvensering. Kvalitetskontrol, der udføres ved hjælp…

Discussion

Den ændrede ATAC-seq protokol præsenteret i denne artikel giver reproducerbare resultater med minimal mitokondriel DNA forurening. Protokollen har været vant til med held karakterisere kromatin arkitektur af menneskelige primære PBMC¹⁰, humane monocytter, mus dendritiske celler (upubliceret), og kulturperler melanom cell linjer¹¹. Vi forventer denne forbedrede lysis betingelse har potentiale til at arbejde for andre celletyper. Det forventes også, at denne kerner isola…

Materials

1X PBS, Sterile	Gibco	10010023	Can use other comparable products.
5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets	Eppendorf	22625501	Can use other comparable products.
96 Well Round Bottom Plate	Thermo Scientific	163320	Can use other comparable products.
Agilent 4200 Tape Station System	Agilent	G2991AA	Suggested for quality assessment.
Cryotubes	Thermo Scientific	374081	Can use other comparable products.
DMSO	Sigma	D8418	Can use other comparable products.
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Invitrogen Life Technologies	11131D	Critical Component
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit	Invitrogen Life Technologies	11346D	Critical Component
Dynamagnet	Invitrogen Life Technologies	12321D	Critical Component
FCS	Gemini Bio Products	100-500	Can use other comparable products.
High Sensitivity DNA Kit	Agilent	50674626	Suggested for quality assessment.
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade	Sigma	M2393	Can use other comparable products.
MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)	Qiagen	28004	Critical Component
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Can use other comparable products.
NaCl, Molecular Biology Grade	Sigma	S3014	Can use other comparable products.
NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix	New England BioLabs	M0541	Critical Component
Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme)	Illumina	FC1211030	Critical Component
Nuclease Free Sterile dH20	Gibco	10977015	Can use other comparable products.
Polysorbate 20 (Tween20)	Sigma	P9416	Can use other comparable products.
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A25780	Critical Component
Precision Water Bath	Thermo Scientific	TSGP02	Can use other comparable products.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	Critical Component
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen Life Technologies	Q32851	Suggested for quality assessment.
Qubit FlouroMeter	Invitrogen Life Technologies	Q33226	Suggested for quality assessment.
Rosette Sep Human CD4+ Density Medium	Stem Cell Technologies	15705	Critical Component
Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail	Stem Cell Technologies	15022	Critical Component
RPMI-1640	Gibco	11875093	Can use other comparable products.
Sterile Resevoir	Thermo Scientific	8096-11	Can use other comparable products.
T100 Thermocycler with Heated Lid	BioRad	1861096	Can use other comparable products.
Tris-HCL	Sigma	T5941	Can use other comparable products.