Управление кластером первоначальный 3D клеток в гибрид геля куб устройство для повторяющихся шаблон образований
Summary
Мы представляем процедуру для контроля первоначальная клеточная кластера фигуру в 3D внеклеточного матрикса получить воспроизводимые модели формирования. Кубических устройство, содержащее два разных гидрогели, используемых для достижения многоцелевые изображения для формирования узор ткани.
Abstract
В пробирке 3D культур значительно подчеркнуто в культуре ткани клеток. Однако отсутствие экспериментальных повторяемость является одним из его ограничений. Несколько повторяемые результаты формирования шаблона ухудшается анализ механизмов, лежащих в основе самоорганизации. Сокращение различий в условиях первоначальной культуры, таких как плотность клеток и распределения в внеклеточного матрикса (ECM), имеет решающее значение для улучшения повторяемости 3D культуры. В этой статье мы демонстрируем простые, но надежные процедуры для контроля первоначальная клеточная кластера фигуру в 3D внеклеточной матрицы для получения высокой повторяемости шаблон образований. Micromold с желаемой формы производилась с помощью фотолитографии или процесс обработки, и он сформировал 3D карман в ECM, содержащихся в Кубе гибрид геля (КГЧ). Высококонцентрированных клетки затем вводили в кармане, так что форма ячеек кластер соответствует сфабрикованные плесень формы. Занятых КГЧ допускается многоцелевые сканирование его вращения, которая позволила изображений с высоким разрешением и захват структуры всей ткани, хотя низкий увеличение объектива была использована. Нормальные человеческие бронхиальной эпителиальные клетки были использованы для демонстрации методологии.
Introduction
Значение 3D культуры, который лучше имитирует биологических сред, чем 2D культуры, значительно подчеркнул в ткани клеток культуры1,2,3. Взаимодействие между клетками и внеклеточного матрикса (ECM) предоставляет важные подсказки относительно морфогенеза4,5. Многие ткани образований может возникнуть только в 3D средах, таких как складной процесса6,7, invagination8и трубчатых формирования9,10. Однако многочисленные трудности предотвратить исследователей от перехода к 3D эксперименты 2D экспериментов на блюдо. Одна из основных трудностей в 3D экспериментов является вопрос о визуализации 3D образцов. По сравнению с плоской эксперименты, приобретения соответствующей 3D изображения по-прежнему сложным во многих случаях. В частности получение соответствующей 3D изображения является трудной задачей, когда размер выборки достигает миллиметрового диапазона из-за большой глубины очага низкой увеличение линз. К примеру глубины очага достигает более чем 50 мкм, когда 10 x увеличение объектива используется в то время как размер одной ячейки составляет обычно менее 10 мкм. Для повышения качества изображения, в настоящее время разрабатываются высокими технологиями микроскопии систем (например, два Фотон микроскопии11 и свет лист микроскопии системы12), но их доступность ограничена ввиду их дорогой ценой. В качестве альтернативы мы разработали ранее гибрид геля устройства куб (КГЧ)13. Устройство состоит из двух видов гидрогели: как гель поддержки и ECM как коллаген или Matrigel как культура гель агарозы. HGC позволяет нам собирать образца при культивировании и вращать куб для достижения многоцелевые изображений, который устраняет проблему глубины очага14.
Еще одна трудность в 3D экспериментов является их низкая воспроизводимость вследствие плохой управляемости 3D средах. В отличие от плоской культуры на пластиковые блюдо вариации в условиях первоначальной культуры легко произойти в трехмерном пространстве, окруженный мягким материалом. Значительные различия в результатах экспериментальной ухудшается после анализа и маски основных механизмов. Многие инженерные технологии были разработаны пространственно выровнять единичных клеток, таких как подложке15,16, волокна, ткачество17и18леса, но они требуют сложной предварительной обработки или специально Дизайн оборудования. В отличие от этого мы разработали методологию для достижения 3D клеток выравнивания в КГЧ19.
В этом протоколе мы иллюстрируется простая процедура с часто используемым оборудованием для контроля 3D первоначальная клеточная форма кластера в КГЧ. Во-первых был продемонстрирован процесс изготовления КГЧ. Затем micromolds сфабрикованы фотолитографии или процесс обработки были помещены в КГЧ производить карман с произвольной формы в ECM. Впоследствии весьма плотной клетки после центрифугирования вводили в карман, чтобы контролировать форму первоначальная клеточная кластера в КГЧ. Точно контролируемой клеток кластера может образы из многих направлений благодаря КГЧ. Нормальные человеческие бронхиальной эпителиальных клеток (NHBE) были использованы для демонстрации элемента управления формы кластера первоначальная клеточная и изображений ветвей с нескольких направлений повышения качества изображений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод, представленный в настоящем документе проста и может выполняться без высокотехнологичного оборудования. Одновременно можно получить точное ячейки кластера форму управления результат в 3D пространстве гидрогеля. После первоначального контроля клетки могут расти в КГЧ как они ку…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была финансово поддержана JSP-страницы KAKENHI (18H 04765) и программу для распространения системы землевладения трек, МПКСНТ, Япония.
Materials
| 12-well-plate | Corning Inc. | 3513 | |
| 2-Methoxy-1-methylethyl Acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 130-10505 | PGMEA, CAS: 108-65-6 |
| 4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 161-20141 | CAS: 30525-89-4 |
| Agarose, low gelling temperature BioReagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Alexa fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| AZ1512 | Merck | ||
| BEGM bullet kit | Lonza | CC-3170 | Specialized medium for NHBE cells |
| Bovine Serum Albumin solution (10 %) | Sigma-Aldrich | A1595 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-3162 | Specialized medium for endothelial cells |
| Lipidure | NOF co. | MPC polymer | |
| Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix | Corning Inc. | 354230 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50197Z | |
| Normal human bronchial epithelial cells | Lonza | CC-2541 | |
| SILPOT 184 W/C | Dow Corning Co. | 3255981 | Base resin and catalyst for PDMS |
| SUEX D300 | DJ MicroLaminates, Inc | Thick negative photoresist (thichness: 300 mm) | |
| Triton X-100 (1%) | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Sasai, Y. Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture. Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -. F. Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).
- Tawk, M., et al. A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis. Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).
- Zegers, M. M. P., O’Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro. Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).
- Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Huisken, J., et al. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. , 1007-1009 (2004).
- Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations. Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).
- Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device. Applied Sciences. 8 (235), (2018).
- Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
- Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. Organ printing: Tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
- Onoe, H., et al. Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions. Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
- Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations. Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
