İlk 3D hücre küme denetimi içinde a Hybrid jel küp aygıt için tekrarlanabilir model oluşumları
Summary
Biz bir tekrarlanabilir model formasyonu elde etmek için 3D bir hücre dışı matriks ilk hücre kümesi şeklinde kontrol etmek için bir yordam mevcut. İki farklı hydrogels içeren bir küp aygıtı doku Desen oluşumu için çok yönlü görüntüleme elde etmek için istihdam edilmektedir.
Abstract
Tüp Bebek 3D kültürler önemini hücre/doku kültürü içinde önemli ölçüde vurguladı. Ancak, deneysel tekrarlanabilirlik eksikliği kendi kısıtlamaları biridir. Desen oluşumu kaç tekrarlanabilir sonuçlar üreten kendi kendine organizasyon altında yatan mekanizmaları analizini bozulur. Hücre yoğunluğu ve hücre dışı Matriks (ECM), dağıtım gibi ilk kültür koşulları varyasyon azaltarak tekrarlanabilirlik 3D bir kültür geliştirmek çok önemlidir. Bu makalede, biz son derece tekrarlanabilir model oluşumları elde etmek için 3D bir hücre dışı matriks ilk hücre kümesi şeklinde denetlemek için basit ama güçlü bir yordamı göstermek. İstenen şeklinde bir micromold fotolitografi veya işleme işlemi kullanılarak imal edilmiştir ve bir melez jel küp (HGC) bulunan ECM, bir 3D cep kurulmuş. Yüksek konsantrasyonlu hücreleri böylece hücre kümesi şekil fabrikasyon kalıp şekli ile eşleşen, cebinde sonra enjekte edildi. İstihdam HGC rağmen düşük-büyütme objektif kullanılan, yüksek çözünürlüklü görüntü ve tüm doku yapısı yakalama etkin onun rotasyon tarafından tarama çok yönlü izin. Normal insan bronş epitel hücreleri metodoloji göstermek için kullanılmıştır.
Introduction
2D bir kültür ondan çok daha iyi taklit eden biyolojik ortamlar, 3D bir kültür önemi oldukça hücre/doku kültürü1,2,3‘ te vurgulanmaktadır. Hücreleri ve hücre dışı Matriks (ECM) arasındaki etkileşimi morfogenez4,5ile ilgili önemli ipuçları sağlar. Birçok doku oluşumları katlama işlemi6,7, invagination8ve borulu oluşumu9,10gibi 3D ortamlar yalnızca altında ortaya çıkabilir. Ancak, çok sayıda zorluklar 3D deneyler için 2D deneylerden bir tabak üzerinde değişen gelen araştırmacılar önlemek. 3D deneylerde büyük zorluklar birini görüntüleme 3D örnekleri konudur. Düzlemsel deneyler ile karşılaştırıldığında, uygun 3D görüntü edinimi birçok durumda hala meydan okuyor. Örnek boyutu milimetre aralığı düşük-büyütme lensler büyük odak derinliği sayesinde ulaştığında özellikle, uygun bir 3D görüntü elde etmek zor bir iştir. Örneğin, tek hücre boyutu normalde az 10 µm ise 10 x büyütme objektif kullanıldığında odak derinliği 50’den fazla µm ulaşır. Görüntü kalitesini artırmak için yüksek teknoloji mikroskobu sistemleri geliştirilmektedir (örneğin, İki fotonlu mikroskobu11 ve ışık sayfalık mikroskobu sistem12), ama onların durumu onların pahalı fiyat nedeniyle sınırlıdır. Alternatif olarak, daha önce bir melez jel küp (HGC) aygıt13geliştirdik. Hydrogels iki tür aygıt oluşur: özel bir destek jel ve kollajen gibi bir ECM ya da Matrigel bir kültür jel olarak olarak. HGC kültür sırasında örnek toplamak ve odak derinliği sorun14adresleri çok yönlü görüntüleme elde etmek için küp döndürmek için bize izin verir.
Başka bir zorluk 3D deneylerde onların düşük tekrarlanabilirlik zavallı kontrol edilebilirlik 3D ortamlar sayesinde olduğunu. Bir plastik tabak bir düzlemsel kültür farklı olarak ilk kültür koşullarında varyasyonları kolayca yumuşak bir malzeme tarafından çevrili 3 boyutlu uzayda meydana gelir. Deneysel sonuçlar önemli bir varyasyon aşağıdaki analizi bozulur ve temel mekanizmaları maskeler. Pek çok mühendislik teknoloji tek hücreleri, bioprinting15,16,17ve İskele18, dokuma fiber gibi dağınık şekilde hizalamak için geliştirilmiştir ancak karmaşık ön işleme gerektirir veya özel olarak tasarlanmış ekipman. Buna ek olarak, 3D hücre hizalama HGC19ulaşmak için bir yöntem geliştirdik.
Bu protokol için bir HGC 3D ilk hücre kümesi şeklinde denetlemek için yaygın olarak kullanılan ekipman ile basit bir yordam gösterilmektedir. İlk olarak, HGC imalat sürecinin gösterilmiştir. Sonra micromolds fotolitografi veya işleme işlemi tarafından fabrikasyon bir cep bir ECM rasgele bir şekli ile üretmeye HGC yerleştirildi. Daha sonra son derece yoğun hücreler Santrifüjü sonra HGC ilk hücre kümesi şeklinde denetlemek için cep içine enjekte edildi. Tam kontrollü hücre kümesi birçok yönden nedeniyle HGC görüntüsü. Normal insan bronş epitel (NHBE) hücreleri görüntü kalitesini arttırmak için birden çok yönden gelen ilk hücre kümesi şekil kontrolünü ve görüntüleme şube göstermek için kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu raporda sunulan yöntem basit ve yüksek teknoloji ekipman yapılabilir. Aynı anda, kesin hücre küme şekil denetimi sonucunda hidrojel 3B alanda elde edilebilir. İlk kontrol sonra bir tabak üzerinde kültürlü oldukları gibi hücreleri HGC içinde büyüyebilir. Çok yönlü görüntüleme herhangi bir mikroskobu sistemi kullanılarak HGC ile örnek döndürerek gerçekleştirilir ve görüntüleme kalitesi önemli ölçüde artırır. Biyouyumlu oldukları gibi HGC çerçeve ve micromold için malzeme seçimi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser mali JSP’ler KAKENHI (18 H 04765) ve görev süresi parça sistemi yaymak, MEXT, Japonya için Program tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 12-well-plate | Corning Inc. | 3513 | |
| 2-Methoxy-1-methylethyl Acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 130-10505 | PGMEA, CAS: 108-65-6 |
| 4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 161-20141 | CAS: 30525-89-4 |
| Agarose, low gelling temperature BioReagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Alexa fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| AZ1512 | Merck | ||
| BEGM bullet kit | Lonza | CC-3170 | Specialized medium for NHBE cells |
| Bovine Serum Albumin solution (10 %) | Sigma-Aldrich | A1595 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-3162 | Specialized medium for endothelial cells |
| Lipidure | NOF co. | MPC polymer | |
| Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix | Corning Inc. | 354230 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50197Z | |
| Normal human bronchial epithelial cells | Lonza | CC-2541 | |
| SILPOT 184 W/C | Dow Corning Co. | 3255981 | Base resin and catalyst for PDMS |
| SUEX D300 | DJ MicroLaminates, Inc | Thick negative photoresist (thichness: 300 mm) | |
| Triton X-100 (1%) | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Sasai, Y. Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture. Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -. F. Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).
- Tawk, M., et al. A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis. Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).
- Zegers, M. M. P., O’Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro. Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).
- Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Huisken, J., et al. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. , 1007-1009 (2004).
- Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations. Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).
- Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device. Applied Sciences. 8 (235), (2018).
- Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
- Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. Organ printing: Tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
- Onoe, H., et al. Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions. Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
- Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations. Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
