Overexpressing lang Noncoding RNAs met behulp van gen-activeren CRISPR
Summary
Traditionele cDNA gebaseerde overexpressie technieken hebben een beperkte toepasbaarheid voor de overexpressie van lang noncoding RNAs als gevolg van hun meerdere splice formulieren met potentiële functionaliteit. Dit overzicht meldt een protocol gebruiken CRISPR technologie om de overexpress van meerdere varianten van het splitsen van een lang noncoding RNA.
Abstract
Lang noncoding RNA (lncRNA) biologie is een nieuwe en spannende gebied van onderzoek, met het aantal publicaties uit dit veld groeien exponentieel sinds 2007. Deze studies hebben bevestigd dat de lncRNAs worden gewijzigd in bijna alle ziekten. Het blijft echter moeilijk te wijten aan het gebrek aan eiwitproducten weefsel-specifieke expressie, lage expressie niveaus, complexiteit in splice vormen, en van behoud onder soorten bestuderen van de functionele rollen voor lncRNAs in het kader van de ziekte. Gezien de soortspecifieke expressie, lncRNA studies zijn vaak beperkt tot menselijk onderzoek contexten bij de studie van ziekteprocessen. Aangezien lncRNAs op moleculair niveau functioneren, is een manier om te ontleden lncRNA biologie te verwijderen van de lncRNA of overexpress van de lncRNA en maatregel cellulaire gevolgen. In dit artikel, wordt een schriftelijke en gevisualiseerde protocol bij lncRNAs in vitro overexpress gepresenteerd. Als een representatieve experiment, is aangetoond dat een lncRNA geassocieerd met inflammatoire darmziekte, Interferon Gamma Antisense 1 (IFNG-AS1), in een Jurkat T-cel-model worden overexpressie. Om dit te bereiken, wordt de activerende geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR)-techniek gebruikt om overexpressie op de endogene genomic loci. De activerende CRISPR techniek richt zich op een reeks van transcriptiefactoren op de site van transcriptionele start van een gen, waardoor een robuuste overexpressie van meerdere lncRNA splice vormen. Deze procedure zal worden opgesplitst in drie stappen, namelijk (i) gids RNA (gRNA) ontwerp en vector constructie, (ii) virus generatie en transductie en (iii) kolonie screening voor overexpressie. Voor dit representatieve experiment, een groter is dan de verhoging van de 20-fold in IFNG-AS1 in Jurkat T-cellen werd waargenomen.
Introduction
Terwijl de meest biomedisch onderzoek is gericht op eiwit-codeert transcripten, bestaat de meerderheid van de getranscribeerde genen eigenlijk uit noncoding RNAs (Ensembl versie 93). Huidige onderzoek begint te verkennen van dit gebied, met het aantal publicaties over lncRNAs in ziekteprocessen stijgt exponentieel tussen 2007 en 20171. Deze publicaties tonen aan dat veel lncRNAs geassocieerd met de ziekte zijn. De moleculaire mechanismen van deze lncRNAs zijn echter moeilijk te studeren als gevolg van hun verschillende functies in vergelijking met mRNAs. Compounding het probleem van het begrip van de rol van lncRNAs in ziekte, worden lncRNAs vaak uitgedrukt op lagere niveaus dan codering RNAs2. Bovendien zijn lncRNAs slecht bewaard, waardoor de functionele studies in de mens-cel-regel-gebaseerde technieken3beperkt. Eén methode om te studeren het mechanisme van deze nieuwe genen is endogeen overexpress hen in gekweekte cellen. Overexpressie studies kunnen belangrijke informatie verschaffen over de functie van specifieke genen en onderzoekers te ontleden belangrijke moleculaire pathways inschakelen.
Een nieuwe methode voor het activeren van de transcriptie van lncRNA genen is gebaseerd op CRISPR technologieën ontwikkeld in eerste instantie door de Gersbach laboratorium4. Dit protocol is aangepast voor gebruik in de biologie van de lncRNA en voor de uitdrukking van deze genen in andere modelsystemen. In de CRISPR overexpressing techniek, kan vallen proteïnen aan genaamd CRISPR-geassocieerde proteïne 9 (Cas9) worden omgeleid naar een DNA-sequentie via een antisense gRNA die door Cas9 wordt herkend. Normaal, Cas9 zal het induceren van DNA splitsingsproducten; echter deactiveren mutaties in Cas9, eerder ontwikkeld voor de overexpressie techniek, deze stap5. Wanneer een transcriptionele activator is gesmolten tot een “dode” Cas9 (dCas9) en getransduceerde in cellijnen, de endogene overexpressie van lncRNAs kan worden bereikt4,6. De toevoeging van extra wijzigingen in de gRNA, waardoor extra transcriptionele factoren te binden aan de gRNA, steeg de werkzaamheid van de activeringssysteem van de dCas9-gen 10-fold7. Nog belangrijker is, het werd aangetoond dat transcriptionele activering nabijheid vereist (< 200 bp) naar de transcriptionele start site genen, waardoor een specifieke opregulatie in gen-rijke gebieden7. In tegenstelling tot CRISPR knock-out technologieën moeten dCas9 en gRNA cassettes worden geïntegreerd in het genoom te voorzien in cellen behouden een overexpressie over meerdere generaties. Een methode om dit te bereiken is het gebruik van lentivirussen te integreren van de dCas9 – en gRNA-bevattende cassettes. Na de integratie, kan de genexpressie lncRNA worden bepaald.
In dit artikel, zal een protocol voor lncRNA overexpressie in een Jurkat T-cel-model worden aangetoond. Een stapsgewijze procedure weergegeven en kan ook worden aangepast naar Adherente cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit manuscript presenteert een protocol voor het gebruik van het activeren van CRISPR voor overexpress lncRNAs in vitro. Dit is een bijzonder belangrijk techniek bij de studie van lange noncoding RNAs zoals het transcriptomic product de functionele eenheid is. Na overexpressie, de onderzoeker, dan kunt deze cellen te verhogen van de signaal-/ ruisverhouding bij de studie van bindende partners en zelfs het meten van de cellulaire gevolgen van lncRNAs wordt verbeterd. Daarnaast zoals lncRNAs vaak over cis-genen handelen, m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.P. wordt ondersteund door RO1 DK60729 en P30 DK 41301-26. D.P. wordt ondersteund door een ziekte van Crohn & Colitis Foundation (CCFA) carrière ontwikkeling award, CURE: spijsvertering ziekten Research Center (DDRC) DK41301, en UCLA klinisch en translationeel Science Institute (CTSI) UL1TR0001881. De kern van de virologie UCLA werd gefinancierd door het centrum van AIDS onderzoek (BVERRE) 5P 30 AI028697 verlenen. De UCLA geïntegreerde moleculaire technologieën kern werd gesteund door CURE/P30 verlenen DK041301. Dit werk werd ook ondersteund door het AIDS-Instituut van UCLA.
Materials
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Miao, Y., et al. Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis. Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).
- Derrien, T., et al. The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression. Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).
- Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Gomez, J. A., et al. The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus. Cell. 152 (4), 743-754 (2013).
- Padua, D., et al. A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).
- Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet. Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).
- Kotake, Y., et al. Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene. Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
- Matouskova, P., et al. Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity. PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).
