CRISPR の遺伝子活性化を使用して長い Rna を過剰発現
Summary
伝統的な cDNA を用いた発現技術の潜在的な機能を持つ、複数のスプライス フォームによる長鎖非コード Rna 発現限定適用しています。このレビューは、長鎖非コード RNA の複数のスプライスバリアント ノザンに CRISPR 技術を使用してプロトコルを報告します。
Abstract
長鎖非コード RNA (lncRNA) 生物学は 2007 年以来指数関数的に成長しているこの分野の出版物の数との研究の新しいでエキサイティングなフィールドです。これらの研究では、lncRNAs は、ほとんどすべての疾患に変更されてことを確認しました。ただし、疾患のコンテキストで lncRNAs の機能的役割を勉強はスプライス フォームの複雑さ、低発現、組織特異的発現タンパク質製品の欠如と種の保全の欠如のために困難。種特異的な発現を与え、lncRNA 研究が多い人間研究の文脈に制限された病気プロセスを学ぶとき。LncRNAs は、分子レベルで機能するので、lncRNA 生物学を分析する方法の 1 つは、lncRNA を削除または lncRNA とメジャーの細胞効果をノザンです。この記事でノザン lncRNAs 体外に書かれ、可視化プロトコルを提案する.代表的な実験としてインターフェロン ガンマ アンチセンス 1 (IFNG AS1)、炎症性腸疾患に関連付けられている、lncRNA は Jurkat T 細胞モデルで過剰に発現するのに表示されます。これを行うには、アクティブ クラスター化された定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR) 技術を使用して、内因性のゲノム遺伝子の過剰発現を有効に。活性化の CRISPR 技術目標は複数 lncRNA スプライス フォームの堅牢な過剰発現を有効に、遺伝子の転写開始サイトに転写因子のセット。この手順は、3 つのステップ、すなわち (i) ガイド RNA (gRNA) 設計とベクトル建設、(ii) ウイルス生成と伝達、および (iii) コロニー発現スクリーニングに分解されます。この代表的な実験のため Jurkat T 細胞における IFNG AS1 で造影効果が 20 よりも大きいのです。
Introduction
最も生物医学研究、蛋白質のコーディングの成績に焦点を当て、転写されている遺伝子の大半は実際に非翻訳 Rna (Ensembl リリース 93) ので構成されます。現在の研究は、2007 年と 20171間に指数関数的に上昇病気プロセスの lncRNAs の出版物の数と、この分野を開拓し始めています。これらの出版物は、多くの lncRNAs が病気に関連付けられているを示しています。ただし、これらの lncRNAs の分子機構は Mrna と比べて多様な機能のための勉強は難しいです。疾患における lncRNAs の役割を理解することの問題を複合、lncRNAs はコーディング RNAs2よりも低いレベルで表されます。さらに、lncRNAs は、人間のセル行ベース テクニック3機能研究を制限する不完全、保存されます。これらの新規遺伝子のメカニズムを勉強する 1 つの方法は、培養細胞でそれらを内生ノザンすることです。過剰発現研究は特定の遺伝子の機能に関して重要な情報を提供し、重要な分子経路を分析する研究者を有効にできます。
LncRNA 遺伝子の転写をアクティブにする新しいメソッドは、ゲルバッチ研究室4によって最初に開発された CRISPR 技術に基づいています。このプロトコルは、lncRNA 生物学で使用するため、他のモデル システムにおけるこれらの遺伝子の表現のために適応されています。テクニックを過剰発現 CRISPR、CRISPR 関連タンパク質 9 (Cas9) と呼ばれるタンパク質は Cas9 によって認識されるアンチセンス gRNA を介して DNA シーケンスへ送信できます。通常、Cas9 を誘発する DNA 切断;ただし、以前過剰発現手法の開発、Cas9 の突然変異は、このステップ5を非アクティブ化します。「死んだ」Cas9 に転写活性化因子を融合するとき (dCas9) 細胞に導入、lncRNAs の内因性の過剰発現は達成4,6をすることができます。その他の転写因子、gRNA にバインドするを有効にする、gRNA に修正を加える添加 dCas9 遺伝子活性化システムの有効性を増加した 10 倍7。重要なは、近接転写活性化が必要であることを示した (< 200 bp)、転写開始サイト遺伝子、遺伝子の豊富なエリア7で特定アップレギュレーションを有効にします。CRISPR ノックアウト技術とは異なり dCas9 と gRNA のカセットは、複数世代にわたって過剰発現を保持する細胞では、ゲノムに統合する必要があります。これを達成する 1 つの方法は、レンチを使用して dCas9 と gRNA を含むカセットを統合することです。統合後、lncRNA の遺伝子発現を決定できます。
この記事で Jurkat T 細胞モデルにおける lncRNA 発現のためのプロトコルが表示されます。ステップバイ ステップの手順が表示され、また付着性のセルに適応することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この原稿は、ノザン lncRNAs 体外に CRISPR のアクティブ化を使用するためのプロトコルを示します。トランスクリプトーム製品は機能ユニット長鎖非コード Rna を勉強するとき、これは特に重要な手法です。過剰発現後研究者は結合パートナーを勉強して、信号対雑音比を増加も lncRNAs の増加レベルの細胞の結果を測定し、これらの細胞を使用できます。さらに、lncRNAs は、cis 遺伝子頻繁に基づ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.P. は、RO1 DK60729 と P30 DK 41301-26 によってサポートされます。D. p. は、クローン ・大腸炎財団 (CCFA) キャリア開発賞、治療によってサポートされて: 消化器系疾患研究センター (DDRC) DK41301 とカリフォルニア大学ロサンゼルス校臨床トランスレーショナル科学研究所 (CTSI) UL1TR0001881。エイズ研究センター (CFAR) によって資金が供給された UCLA ウイルス コア 5 P 30 AI028697 を付与します。カリフォルニア大学ロサンゼルス校統合分子技術コアに支えられた治療法/P30 は、DK041301 を付与します。この作品は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校エイズ研究所に支えられ。
Materials
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
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