Monster voorbereiding methode van scannen en transmissie elektronenmicroscoop voor de aanhangsels van woodboring Kever
Summary
Om ultrastructuur van insectensensilla te observeren, werd in de studie het protocol voor de voorbereiding van de insectenensilla, scanning en transmissieelektronenmicroscopie (SEM en TEM) in de studie gepresenteerd. Tween 20 werd toegevoegd aan de fixatie om monstervervorming in SEM te voorkomen. Fluorescentiemicroscopie was nuttig voor het verbeteren van de snijnauwkeurigheid in TEM.
Abstract
Dit rapport beschreef monsterbereidingsmethoden die waarnemingen van elektronenmicroscoops scannen en transmissieën, aangetoond door het voorbereiden van aanhangsels van de houtboorkever, Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012), voor beide soorten elektronenmicroscopie. Het protocol voor de voorbereiding van het monster van scanning electron microscopy (SEM) was gebaseerd op monsterchemische fixatie, uitdroging in een reeks ethanolbaden, drogen en sputtercoating. Door Tween 20 (Polyoxyethyleen sorbitan laurate) toe te voegen aan de fixatieve en wasoplossing, werd het insectenlichaamsoppervlak van houtboringkever gereinigder gewassen in SEM. Deze studie transmissie elektronenmicroscopie (TEM) monster voorbereiding betrokken een reeks stappen, waaronder fixatie, ethanol uitdroging, inbedding in hars, positionering met behulp van fluorescentie microscopie, sectioning, en vlekken. Fixatief met Tween 20 ingeschakeld doordringen de insecten lichaam muur van houtboring kever gemakkelijker dan het zou zijn geweest zonder Tween 20, en vervolgens beter vaste weefsels en organen in het lichaam, dus leverde duidelijke transmissie elektronenmicroscoop waarnemingen van insect sensilla ultrastructuren. De volgende stap van dit preparaat was het bepalen van de posities van insectensensilla in het monster ingebed in het harsblok met behulp van fluorescentiemicroscopie om de precisie van de positionering van het doel sensilla te verhogen. Dit verbeterde snijnauwkeurigheid.
Introduction
Scanning elektronenmicroscopie is een belangrijk instrument in veel morfologie studies, dat SEM oppervlaktestructuren1,2toont. De aantrekkingskracht van transmissieelektronenmicroscopie is dat het kan worden gebruikt om een breed scala aan biologische structuren op nanometerschaal te bestuderen, van de architectuur van cellen en de ultrastructuur van organellen, tot de structuur van macromoleculaire complexen en eiwitten. TEM toont binnenstructuren3,4,5.
Coleoptera is de grootste groep insecten, waaronder ongeveer 182 families en 350.000 soorten. De meeste coleopteran insecten, in het bijzonder houtboring kever, voeden zich met planten, waarvan vele belangrijke plagen van bossen en fruitbomen, waardoor verwoestende schade aan bomen6. Op dit moment hebben preventie en bestrijding van plagen op basis van chemische ecologie theorie steeds meer aandacht gekregen7. Efficiënte, laag-toxische, vervuiling-vrije feromoon controle methoden zijn uitgegroeid tot een effectieve manier8. Het bestuderen van de sensilla morfologie en ultrastructuur van insecten is een belangrijk onderdeel van het onderzoek naar de chemische ecologie van insecten. De scanning en transmissie elektronenmicroscopie (SEM en TEM, respectievelijk) worden gebruikt om hun morfologie en interne anatomie te bestuderen. Tijdens de bereiding van insectenmonsters voor elektronenmicroscopie (EM) kunnen de objectiviteit en authenticiteit van de observatieplaats echter worden aangetast9. In het algemeen vereist SEM-monstervoorbereiding van insecten reiniging, weefselfixatie, uitdroging, metathesis, drogen en sputtercoating10. Door de complexe omgeving waarin houtboring kever leven, het lichaamsoppervlak heeft vaak verschillende verontreinigende stoffen en hun aanhangsels hebben vaak veel fijne lange sensilla of haren. In het bijzonder zijn sommige houtborers niet beschikbaar bij laboratoriumverhoging, die rechtstreeks in het veld werden verzameld, en vervolgens in bevestigingsvloeistof worden gestopt om de versheid te garanderen en vervolgens in het laboratorium te wassen. Als het monster eerst wordt bevestigd en vervolgens gewassen, is het natuurlijk veel moeilijker om puin te verwijderen, omdat glutaraldehyde het sterk aan het monster bevestigt. Tween 20 is een oppervlakteactievestof 11,12,13,14, die een belangrijke rol speelt in het wasproces, waaronder het verminderen van de oppervlaktespanning van water en het verbeteren van de nattbaarheid van water op het oppervlak van de wasserij. In deze studie werd Tween 20 toegevoegd aan de bevestigingsoplossing en PBS-reinigingsoplossing om de oppervlaktespanning van de vloeistof te verminderen en te voorkomen dat het vuil op het lichaamsoppervlak van de houtboorkever terechtkwam, waardoor het lichaamsoppervlak schoner werd in SEM.
Met behulp van TEM kan sensilla op verschillende organen van insecten worden gesneden om de duidelijke structuren in hen te onthullen, waardoor een basis wordt gelegd voor het analyseren van sensilla-functies. Wanneer het onderwerp insect, zoals houtboring kever, is groot, en het lichaam muur heeft een aanzienlijke mate van sclerotization, dus de fixatie kan niet volledig verzadigen orgaanweefsels in het insectenlichaam. Tween 20 kan de dispersie- en suspensiecapaciteit van het vuil verbeteren. In deze studie werd Tween 20 toegevoegd aan de fixatieve vloeistofpenetratie in de insectenlichaamwand van houtboringkever, waardoor vervorming en instorting van de opperhuid11,12,13werd voorkomen. Bovendien, met behulp van algemene snijtechnologie, is het moeilijk om nauwkeurig te lokaliseren verschillende soorten sensilla, met name voor een aantal kleine sensilla15. Op basis van traditionele TEM monstervoorbereiding combineerde deze studie fluorescentiemicroscopie en SEM om de positie van insectensensilla in het ingebedde blok te bepalen, waardoor de snijnauwkeurigheid werd verbeterd.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel presenteerden we een monster voorbereiding sschema voor scanning en transmissie elektronenmicroscopie voor houtboring kever. Met behulp van insectenaanhangsel als representatief studieonderwerp hebben we verschillende verbeteringen ten opzichte van traditionele monsterbereidingsmethoden aangetoond.
De vloeibare olie die loskomt van het vaste oppervlak wordt geëmulgeerd tot kleine druppeltjes, die goed kunnen worden verspreid en opgehangen in het wasmedium om het opnieuw storten…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij waarderen de genereuze hulp van de Beijing Vocational College of Agriculture, het Institute for the Application of Atomic Energy (Chinese Academy of Agricultural Science), het Bioresearch Center van Beijing Forestry University en professor Shan-gan Zhang van het Instituut voor Zoölogie, Chinese Academie van Wetenschappen. Dit onderzoek werd ondersteund door National Key R&D Program of China (2017YFD0600103), de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31570643, 81774015), Forest Scientific Research in the Public Welfare of China (201504304), Inner Mongolië Landbouwuniversiteit High-level Talent Research Startup Plan (203206038), en Binnen-Mongolië Autonome Regio Hoger Onderwijs Research Project (NJZZ18047), Binnen-Mongolië Autonome Regio Linxue “Double First-class” Bouwproject (170001).
Materials
| Anatomical lens | Chongqing Auto Optical limited liability company |
1425277 | |
| Carbon adhesive tape | SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc. | 7311 | |
| Carbon tetrachloride | Sigma | 56-23-5 | |
| Copper grids | GilderGrids | G300 | |
| Disodium hydrogen phosphate | Sinopharm group chemical reagent co., LTD | 10039-32-4 | |
| Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
| Flat embedding molds | Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | 70900 | |
| Fluorescence microscope | LEICA | DM2500 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | Anhydrous EM Grade |
| Isophorone | Sigma | 78-59-1 | |
| Lead citrate | Sigma | 512-26-5 | |
| Methanol | Sigma | 67-56-1 | |
| Monobasic sodium phosphate | Its group chemical reagent co., LTD | 7558-80-7 | |
| Objective micrometer | Olympus | 0-001-034 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 541-09-3 | |
| Petri dish | Aldrich | 1998 | |
| Razor blade | Gillette | ||
| Resin | Spurr | ERL4221 | |
| Scalpel | Lianhui | GB/T19001-2008 | |
| SEM | Hitachi | S-3400 | |
| Silica gel desiccant | Suzhou Longhui Desiccant Co., Ltd. | 112926-00-8 | |
| Small brush | Martol | G1220 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sputter ion instrument | Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Japan | E-1010 | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 HD | |
| TEM | Hitachi | H-7500 | |
| Tween 20 | Tianjin Damao Chemical Reagent | 9005-64-5 | |
| Ultramicrotome | Leica | UC6 | |
| Ultrasonic cleaner | GT Sonic | GT-X1 | |
| Uranyl acetate | Sigma | 6159-44-0 |
References
- Song, Y. Q., Dong, J. F., Sun, H. Z. Scanning Electron Microscope Technology of Insect Material. Hubei Agricultural Sciences. 52, 1064-1065 (2013).
- Liu, C. The development of the scanning electron microscopy (sem) and its application in polymer materials research. Journal of the Graduates Sun Yat-Sen University (Natural Sciences Medicine). 34, 7-12 (2008).
- Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Quarterly Reviews of Biophysics. 45, 27-56 (2011).
- Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. The Journal of Cell Biology. 202, 407-419 (2013).
- Trepout, S., Bastin, P., Marco, S. Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (121), e55215 (2017).
- Zhang, X. J., Sun, W., Zhang, J., Zuo, T. T., Wang, Z. Q., Zhao, H. W. Research progress of coleopteran insect species antennal sensilla. Journal of Anhui Agricultural Sciences. 41, 2932-2935 (2013).
- Aldrich, J. R., Bartelt, R. J., Dickens, J. C., Knight, A. L., Light, D. M., Tumlinson, J. H. Insect chemical ecology research in the United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service. Pest Management Science. 59, 777-787 (2003).
- Thomas, C. B., Marlin, E. R. Pheromone mating disruption: Novel, non-toxic control of the European corn borer. Leopold Center. 8, 57-60 (1999).
- Chen, X. F., Hu, M. Y. Studies on the specimen preparation techniques of scanning electron microscope of Ficus simplicissima Lour. Journal of Zhongkai Agrotechnical College. 14, 68-70 (2001).
- Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z. L., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy (SEM). Scanning Microscopy for Nanotechnology. , 1-40 (2006).
- Kothekar, S. C., Ware, A. M., Waghmare, J. T., Momin, S. A. Comparative Analysis of the Properties of Tween-20, Tween-60, Tween-80, Arlacel-60, and Arlacel-80. Journal of Dispersion Science and Technology. 28, 477-484 (2007).
- Chai, J. L., Liu, N., Bai, T. T., Zhang, H. M., Liu, N. N., Wang, D. D. Compositions and Physicochemical Properties of Tween Type Surfactants-Based Microemulsions. Journal of Dispersion Science and Technology. 35, 441-447 (2014).
- Zhang, L. D., Zhao, L., Han, F., Xu, B. C. Performance and applications of surfactants (XV) Detergency of surfactants and its applications. China Surfactant Detergent and Cosmetics. 45, 132-137 (2015).
- Waghmare, P. R., Das, S., Mitra, S. K. Under-water superoleophobic glass: unexplored role of the surfactant-rich solvent. Scientific Reports. 3, 1-25 (2013).
- Zhang, Y. R., Ren, L. L., Luo, Y. Q. Microtomy of insect sensilla embedded in resin blocks for transmission electronic microscopy. Chinese Journal of Applied Entomology. 50, 1479-1483 (2013).
- Zong, S. X., Liu, X. H., Cao, C. J., Luo, Y. Q., Ren, L. L., Zhang, H. Development of semiochemical attractants for monitoring and controlling Chlorophorus caragana. Zeitschrift für Naturforschung. 68, 243-252 (2013).
- Sumner, M. J. Epoxy resins for light and transmission electron microscopy. Plant Microtechniques and Protocols. , 83-101 (2015).
- Schneider, D. Insect antennae. Annual Review of Entomology. 9, 103-122 (1964).
- Zacharuk, R. Antennae and sensilla. Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 6, 1-69 (1985).
- Zacharuk, R., Albert, P., Bellamy, F. Ultrastructure and function of digitiform sensilla on the labial palp of a larval elaterid (Coleoptera). Canadian Journal of Zoology. 55, 569-578 (1977).
- Shanbhag, S., Müller, B., Steinbrecht, R. Atlas of olfactory organs of Drosophila melanogaster: 1, Types, external organization, innervation and distribution of olfactory sensilla. International Journal of Insect Morphology and Embryology. 28, 377-397 (1999).
- Tarumingkeng, R. C., Coppel, H. C., Matsumura, F. Morphology and ultrastructure of the antennal chemoreceptors and mechanoreceptors of worker Coptotermes formosanus Shiraki. Cell Tissue Res. 173, 173-178 (1976).
- Zacharuk, R. Y. Ultrastructure and function of insect chemosensilla. Annual Review of Entomology. 25, 27-47 (1980).
- Li, Y. Z., Zhong, G. Q. Screening of detergents and floating carriers for treating potato golden nematode cysts to improve the original appearance of electron microscopy. Plant quarantine. 8, 72-75 (1994).
- Marzio, L. D., Marianecci, C., Petrone, M., Rinaldi, F., Carafa, M. Novel pH-sensitive non-ionic surfactant vesicles: comparison between tween 21 and tween 20. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 82, 18-24 (2011).
- Ren, L. L., Wu, Y., Shi, J., Zhang, L., Luo, Y. Q. Antenna morphology and sensilla ultrastructure of Tetrigus lewisi Candèze (Coleoptera: Elateridae). Micron. 60, 29-38 (2014).
- Ren, L., Shi, J., Zhang, Y., Luo, Y. Antennal morphology and sensillar ultrastructure of Dastarcus helophoroides (Fairmaire) (Coleoptera: Bothrideridae). Micron. 43, 921-928 (2012).
- Teng, X. H., Liu, X. L., Xie, G. Y., Tang, Q. B., Li, W. Z., Zhao, X. C. Morphology and distribution of ovipositor sensilla of female Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae). The 11th Henan Plant Protection Society, the 10th Henan Insect Society, and the 5th Member Congress and Academic Symposium of Henan Plant Pathology Society. , 138-142 (2017).
- Yang, R., Zhang, L. N., Fan, J. W., Wang, J. L., Fang, K. F., Yu, T. Q., Wang, S. H., Du, Y. L. Insect specimens for scanning electron microscopy. Journal of Beijing University of Agriculture. 29, 33-36 (2014).
- Zhang, Y. R., Ren, L. L., Zhang, L., Wang, R., Yu, Y., Lu, P. F., Luo, Y. Q. Ultrastructure and distribution of sensilla on the maxillary and labial palps of Chlorophorus caragana (Coleoptera: Cerambycidae). Journal of Morphology. 279, 574-588 (2018).
- Harrison, J. D. G. Cleaning and preparing adult beetles (Coleoptera) for light and scanning electron microscopy. African Entomology. 20, 395-401 (2012).
- Xiao, Y., Liu, W., Wang, Y., Zuo, Y. X., Hu, R., Li, T. T., Cui, Z. B. Drying methods of biological sample preparation for scanning electron microscope. Research and Exploration Laboratory. 32, 46-53 (2013).
- Graef, M. D. . Introduction to Conventional Transmission Electron Microscopy. , 1 (2003).
