Probenvorbereitungsmethode des Raster- und Transmissionselektronenmikroskops für die Anhänge von Woodboring Beetle
Summary
Zur Beobachtung der Ultrastruktur von Insektensensilla wurden in der Studie Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie (SEM bzw. TEM) zur Probenvorbereitung vorgestellt. Tween 20 wurde in das Fixativ aufgenommen, um Probenverformungen in SEM zu vermeiden. Fluoreszenzmikroskopie war hilfreich, um die Schnittgenauigkeit in TEM zu verbessern.
Abstract
Dieser Bericht beschrieb Probenvorbereitungsmethoden, die Raster- und Transmissionselektronenmikroskop-Beobachtungen, die durch die Vorbereitung von Anhängsel des Holzbohrkäfers Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012) für beide Arten der Elektronenmikroskopie demonstriert wurden. Das Rasterelektronenmikroskopieprotokoll (SEM) basierte auf probenchemischer Fixierung, Dehydrierung in einer Reihe von Ethanolbädern, Trocknung und Sputterbeschichtung. Durch Zugabe von Tween 20 (Polyoxyethylen-Sorbitan-Laurat) zur Fixier- und Waschlösung wurde die Insektenkörperoberfläche des Holzbohrkäfers im SEM sauberer gewaschen. Die Probenvorbereitung der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) in dieser Studie umfasste eine Reihe von Schritten, einschließlich Fixierung, Ethanoldehydrierung, Einbettung in Harz, Positionierung mittels Fluoreszenzmikroskopie, Schnittung und Färbung. Fixative mit Tween 20 aktiviert eindringen die Insektenkörperwand von Holzbohrkäfer leichter als es ohne Tween 20 gewesen wäre, und in der Folge bessere feste Gewebe und Organe im Körper, so ergab klare Transmission Elektronenmikroskop Beobachtungen von Insekten sensilla Ultrastrukturen. Der nächste Schritt dieser Vorbereitung war die Bestimmung der Positionen der Insektensensorilla in der im Harzblock eingebetteten Probe durch die Verwendung der Fluoreszenzmikroskopie, um die Präzision der Zielsensilla-Positionierung zu erhöhen. Dies verbesserte die Schnittgenauigkeit.
Introduction
Die Rasterelektronenmikroskopie ist ein wichtiges Werkzeug in vielen Morphologiestudien, dass SEM Oberflächenstrukturen1,2zeigt. Der Reiz der Transmissionselektronenmikroskopie ist, dass sie verwendet werden kann, um eine breite Palette biologischer Strukturen im Nanometermaßstab zu untersuchen, von der Architektur der Zellen und der Ultrastruktur von Organellen bis hin zur Struktur makromolekularer Komplexe und Proteine. TEM zeigt innere Strukturen3,4,5.
Coleoptera ist die größte Insektengruppe, darunter etwa 182 Familien und 350.000 Arten. Die meisten der coleopteran Insekten, insbesondere Holzbohrkäfer, ernähren sich von Pflanzen, von denen viele wichtige Schädlinge von Wäldern und Obstbäumen sind, die verheerende Schäden an Bäumenverursachen 6. Zur Zeit, Prävention und Kontrolle Der Population von Schädlingen auf der Grundlage der chemischen Ökologie Theorie haben immer mehr Aufmerksamkeit erhalten7. Effiziente, niedriggiftige, schadstofffreie Pheromon-Kontrollmethoden sind zu einem effektiven Weg geworden8. Das Studium der Sensilla-Morphologie und Ultrastruktur von Insekten ist ein wichtiger Teil der chemischen Ökologieforschung in Insekten. Die Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie (SEM bzw. TEM) wird zur Untersuchung ihrer Morphologie und inneren Anatomie eingesetzt. Bei der Vorbereitung von Insektenproben für die Elektronenmikroskopie (EM) kann jedoch die Objektivität und Authentizität der Beobachtungsstelle beeinträchtigt werden9. Im Allgemeinen erfordert die SEM-Probenvorbereitung von Insekten Reinigung, Gewebefixierung, Dehydrierung, Metathesen, Trocknung und Sputterbeschichtung10. Aufgrund der komplexen Umgebung, in der Holzbohrkäfer leben, hat die Körperoberfläche oft verschiedene Schadstoffe und ihre Anhängsel haben oft viele feine lange Sensilla oder Borsten. Insbesondere sind einige Holzträger nicht aus der Laboraufzucht erhältlich, die direkt im Feld gesammelt und dann in Befestigungsflüssigkeit gesteckt werden, um frische seramungzumachen und anschließend im Labor zu waschen. Wenn die Probe zuerst fixiert und dann gewaschen wird, ist es offensichtlich viel schwieriger, Schmutz zu entfernen, da Glutaraldehyd sie stark an der Probe fixiert. Tween 20 ist ein Tensid11,12,13,14, das eine wichtige Rolle im Waschprozess spielt, einschließlich der Verringerung der Oberflächenspannung von Wasser und der Verbesserung der Benetzbarkeit von Wasser auf der Oberfläche der Wäsche. In dieser Studie wurde Tween 20 der Befestigungslösung und der PBS-Reinigungslösung hinzugefügt, um die Oberflächenspannung der Flüssigkeit zu reduzieren und zu verhindern, dass sich der Schmutz auf der Körperoberfläche des Holzbohrkäfers ablagert, was die Körperoberfläche in SEM sauberer machte.
Mit TEM können Sensilla an verschiedenen Insektenorganen in Scheiben geschnitten werden, um die klaren Strukturen in ihnen zu offenbaren und so eine Grundlage für die Analyse von Sensilla-Funktionen zu schaffen. Wenn das Subjekt Insekt, wie Holzbohrkäfer, groß ist, und seine Körperwand hat einen erheblichen Grad an Sklerotisierung, so dass das Fixativ kann nicht vollständig gesättigt Organgewebe im Inneren des Insektenkörpers. Tween 20 kann die Dispersions- und Aufhängungskapazität des Schmutzes verbessern. In dieser Studie wurde Tween 20 dem Fixativ hinzugefügt, um das Fixative Flüssigkeitsdurchdringung in die Insektenkörperwand des Holzbohrkäfers zu verbessern, um Verformungen und Denkollaps des Epidermi11,12,13zu vermeiden. Darüber hinaus ist es mit der allgemeinen Schneidetechnologie schwierig, verschiedene Arten von Sensilla genau zu lokalisieren, insbesondere für einige kleine Sensilla15. Basierend auf der traditionellen TEM-Probenvorbereitung kombinierte diese Studie Fluoreszenzmikroskopie und SEM, um die Position von Insektensensilla im eingebetteten Block zu bestimmen und so die Schnittgenauigkeit zu verbessern.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel haben wir ein Probenvorbereitungsschema für die Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie für Holzbohrkäfer vorgestellt. Anhand des Insektenanhängsals als repräsentatives Studienfach haben wir einige Verbesserungen gegenüber herkömmlichen Probenvorbereitungsmethoden gezeigt.
Das von der festen Oberfläche gelöste flüssige Öl wird zu kleinen Tröpfchen emulgiert, die gut dispergiert und im Waschmedium aufgehängt werden können, um die Rückablagerung auf der Ob…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir schätzen die großzügige Unterstützung des Beijing Vocational College of Agriculture, des Institute for the Application of Atomic Energy (Chinese Academy of Agricultural Science), des Bioresearch Center of Beijing Forestry University und Professor Shan-gan Zhang vom Institut für Zoologie der Chinesischen Akademie der Wissenschaften. Diese Forschung wurde unterstützt durch national Key R&D Program of China (2017YFD0600103), die National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31570643, 81774015), Forest Scientific Research in the Public Welfare of China (201504304), Inner Mongolia Agricultural University High-Level Talent Research Startup Plan (203206038) und Inner Mongolia Autonomous Region Higher Education Research Project (NJZZ18047), Inner Mongolia Autonomous Region Linxue “Double First-class” Construction Project (170001).
Materials
| Anatomical lens | Chongqing Auto Optical limited liability company |
1425277 | |
| Carbon adhesive tape | SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc. | 7311 | |
| Carbon tetrachloride | Sigma | 56-23-5 | |
| Copper grids | GilderGrids | G300 | |
| Disodium hydrogen phosphate | Sinopharm group chemical reagent co., LTD | 10039-32-4 | |
| Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
| Flat embedding molds | Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | 70900 | |
| Fluorescence microscope | LEICA | DM2500 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | Anhydrous EM Grade |
| Isophorone | Sigma | 78-59-1 | |
| Lead citrate | Sigma | 512-26-5 | |
| Methanol | Sigma | 67-56-1 | |
| Monobasic sodium phosphate | Its group chemical reagent co., LTD | 7558-80-7 | |
| Objective micrometer | Olympus | 0-001-034 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 541-09-3 | |
| Petri dish | Aldrich | 1998 | |
| Razor blade | Gillette | ||
| Resin | Spurr | ERL4221 | |
| Scalpel | Lianhui | GB/T19001-2008 | |
| SEM | Hitachi | S-3400 | |
| Silica gel desiccant | Suzhou Longhui Desiccant Co., Ltd. | 112926-00-8 | |
| Small brush | Martol | G1220 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sputter ion instrument | Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Japan | E-1010 | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 HD | |
| TEM | Hitachi | H-7500 | |
| Tween 20 | Tianjin Damao Chemical Reagent | 9005-64-5 | |
| Ultramicrotome | Leica | UC6 | |
| Ultrasonic cleaner | GT Sonic | GT-X1 | |
| Uranyl acetate | Sigma | 6159-44-0 |
References
- Song, Y. Q., Dong, J. F., Sun, H. Z. Scanning Electron Microscope Technology of Insect Material. Hubei Agricultural Sciences. 52, 1064-1065 (2013).
- Liu, C. The development of the scanning electron microscopy (sem) and its application in polymer materials research. Journal of the Graduates Sun Yat-Sen University (Natural Sciences Medicine). 34, 7-12 (2008).
- Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Quarterly Reviews of Biophysics. 45, 27-56 (2011).
- Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. The Journal of Cell Biology. 202, 407-419 (2013).
- Trepout, S., Bastin, P., Marco, S. Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (121), e55215 (2017).
- Zhang, X. J., Sun, W., Zhang, J., Zuo, T. T., Wang, Z. Q., Zhao, H. W. Research progress of coleopteran insect species antennal sensilla. Journal of Anhui Agricultural Sciences. 41, 2932-2935 (2013).
- Aldrich, J. R., Bartelt, R. J., Dickens, J. C., Knight, A. L., Light, D. M., Tumlinson, J. H. Insect chemical ecology research in the United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service. Pest Management Science. 59, 777-787 (2003).
- Thomas, C. B., Marlin, E. R. Pheromone mating disruption: Novel, non-toxic control of the European corn borer. Leopold Center. 8, 57-60 (1999).
- Chen, X. F., Hu, M. Y. Studies on the specimen preparation techniques of scanning electron microscope of Ficus simplicissima Lour. Journal of Zhongkai Agrotechnical College. 14, 68-70 (2001).
- Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z. L., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy (SEM). Scanning Microscopy for Nanotechnology. , 1-40 (2006).
- Kothekar, S. C., Ware, A. M., Waghmare, J. T., Momin, S. A. Comparative Analysis of the Properties of Tween-20, Tween-60, Tween-80, Arlacel-60, and Arlacel-80. Journal of Dispersion Science and Technology. 28, 477-484 (2007).
- Chai, J. L., Liu, N., Bai, T. T., Zhang, H. M., Liu, N. N., Wang, D. D. Compositions and Physicochemical Properties of Tween Type Surfactants-Based Microemulsions. Journal of Dispersion Science and Technology. 35, 441-447 (2014).
- Zhang, L. D., Zhao, L., Han, F., Xu, B. C. Performance and applications of surfactants (XV) Detergency of surfactants and its applications. China Surfactant Detergent and Cosmetics. 45, 132-137 (2015).
- Waghmare, P. R., Das, S., Mitra, S. K. Under-water superoleophobic glass: unexplored role of the surfactant-rich solvent. Scientific Reports. 3, 1-25 (2013).
- Zhang, Y. R., Ren, L. L., Luo, Y. Q. Microtomy of insect sensilla embedded in resin blocks for transmission electronic microscopy. Chinese Journal of Applied Entomology. 50, 1479-1483 (2013).
- Zong, S. X., Liu, X. H., Cao, C. J., Luo, Y. Q., Ren, L. L., Zhang, H. Development of semiochemical attractants for monitoring and controlling Chlorophorus caragana. Zeitschrift für Naturforschung. 68, 243-252 (2013).
- Sumner, M. J. Epoxy resins for light and transmission electron microscopy. Plant Microtechniques and Protocols. , 83-101 (2015).
- Schneider, D. Insect antennae. Annual Review of Entomology. 9, 103-122 (1964).
- Zacharuk, R. Antennae and sensilla. Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 6, 1-69 (1985).
- Zacharuk, R., Albert, P., Bellamy, F. Ultrastructure and function of digitiform sensilla on the labial palp of a larval elaterid (Coleoptera). Canadian Journal of Zoology. 55, 569-578 (1977).
- Shanbhag, S., Müller, B., Steinbrecht, R. Atlas of olfactory organs of Drosophila melanogaster: 1, Types, external organization, innervation and distribution of olfactory sensilla. International Journal of Insect Morphology and Embryology. 28, 377-397 (1999).
- Tarumingkeng, R. C., Coppel, H. C., Matsumura, F. Morphology and ultrastructure of the antennal chemoreceptors and mechanoreceptors of worker Coptotermes formosanus Shiraki. Cell Tissue Res. 173, 173-178 (1976).
- Zacharuk, R. Y. Ultrastructure and function of insect chemosensilla. Annual Review of Entomology. 25, 27-47 (1980).
- Li, Y. Z., Zhong, G. Q. Screening of detergents and floating carriers for treating potato golden nematode cysts to improve the original appearance of electron microscopy. Plant quarantine. 8, 72-75 (1994).
- Marzio, L. D., Marianecci, C., Petrone, M., Rinaldi, F., Carafa, M. Novel pH-sensitive non-ionic surfactant vesicles: comparison between tween 21 and tween 20. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 82, 18-24 (2011).
- Ren, L. L., Wu, Y., Shi, J., Zhang, L., Luo, Y. Q. Antenna morphology and sensilla ultrastructure of Tetrigus lewisi Candèze (Coleoptera: Elateridae). Micron. 60, 29-38 (2014).
- Ren, L., Shi, J., Zhang, Y., Luo, Y. Antennal morphology and sensillar ultrastructure of Dastarcus helophoroides (Fairmaire) (Coleoptera: Bothrideridae). Micron. 43, 921-928 (2012).
- Teng, X. H., Liu, X. L., Xie, G. Y., Tang, Q. B., Li, W. Z., Zhao, X. C. Morphology and distribution of ovipositor sensilla of female Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae). The 11th Henan Plant Protection Society, the 10th Henan Insect Society, and the 5th Member Congress and Academic Symposium of Henan Plant Pathology Society. , 138-142 (2017).
- Yang, R., Zhang, L. N., Fan, J. W., Wang, J. L., Fang, K. F., Yu, T. Q., Wang, S. H., Du, Y. L. Insect specimens for scanning electron microscopy. Journal of Beijing University of Agriculture. 29, 33-36 (2014).
- Zhang, Y. R., Ren, L. L., Zhang, L., Wang, R., Yu, Y., Lu, P. F., Luo, Y. Q. Ultrastructure and distribution of sensilla on the maxillary and labial palps of Chlorophorus caragana (Coleoptera: Cerambycidae). Journal of Morphology. 279, 574-588 (2018).
- Harrison, J. D. G. Cleaning and preparing adult beetles (Coleoptera) for light and scanning electron microscopy. African Entomology. 20, 395-401 (2012).
- Xiao, Y., Liu, W., Wang, Y., Zuo, Y. X., Hu, R., Li, T. T., Cui, Z. B. Drying methods of biological sample preparation for scanning electron microscope. Research and Exploration Laboratory. 32, 46-53 (2013).
- Graef, M. D. . Introduction to Conventional Transmission Electron Microscopy. , 1 (2003).
