वुडबोरिंग बीटल के परिशिष्ट के लिए स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का नमूना तैयारी विधि
Summary
अध्ययन में कीट सेंसिला, स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम और टीईएम, क्रमशः) नमूना तैयारी प्रोटोकॉल के अल्ट्रास्ट्रक्चर का निरीक्षण करने के लिए प्रस्तुत किया गया था। Tween 20 को सेम में नमूना विरूपण से बचने के लिए फिक्सेटिव में जोड़ा गया था । फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी TEM में टुकड़ा करने की क्रिया सटीकता में सुधार के लिए मददगार था ।
Abstract
इस रिपोर्ट में नमूना तैयारी विधियों का वर्णन किया गया है कि स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप टिप्पणियों, वुडबोरिंग बीटल, क्लोरोफोरस कैरागण Xie और वांग (२०१२) के उपांग तैयार करके प्रदर्शन किया, दोनों प्रकार के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए । स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) नमूना तैयारी प्रोटोकॉल नमूना रासायनिक निर्धारण, इथेनॉल स्नान, सुखाने और स्पंदन-कोटिंग की एक श्रृंखला में निर्जलीकरण पर आधारित था। स्थिर और वॉश समाधान में ट्वीन 20 (पॉलीऑक्सीएथिलीन सोर्बियन लॉरेट) जोड़कर, सेम में वुडबोरिंग बीटल की कीट शरीर की सतह को अधिक सफाई से धोया गया था। इस अध्ययन के ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) नमूना तैयार करने में निर्धारण, इथेनॉल निर्जलीकरण, राल में एम्बेडिंग, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, सेक्शनिंग और धुंधला होने सहित कई कदम शामिल थे। ट्वीन 20 सक्षम के साथ फिक्स्टिव वुडबोरिंग बीटल की कीट शरीर की दीवार को अधिक आसानी से प्रवेश करता है, जो ट्वीन 20 के बिना होता था, और बाद में बेहतर निश्चित ऊतकों और शरीर में अंगों को, इस प्रकार कीट सेंसिला अल्ट्रास्ट्रक्चर के स्पष्ट ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप अवलोकन मिले। इस तैयारी का अगला कदम लक्ष्य सेंसिला पोजिशनिंग की सटीकता बढ़ाने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके राल ब्लॉक में एम्बेडेड नमूने में कीट सेंसिला की स्थिति का निर्धारण करना था। यह टुकड़ा करने की क्रिया सटीकता में सुधार हुआ ।
Introduction
स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी कई आकृति विज्ञान अध्ययनों में एक महत्वपूर्ण उपकरण है, जो एसईएम सतह संरचनाओंको दिखाताहै1,2। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की अपील यह है कि इसका उपयोग नैनोमीटर पैमाने पर जैविक संरचनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, कोशिकाओं की वास्तुकला और ऑर्गेनेल्स के अल्ट्रास्ट्रक्चर से, मैक्रोमॉलिक्यूलर कॉम्प्लेक्स और प्रोटीन की संरचना तक। टेम आंतरिक संरचनाओं3,4,5दिखाता है ।
कोलोप्टेरा कीड़ों का सबसे बड़ा समूह है, जिसमें लगभग 182 परिवार और 350,000 प्रजातियां शामिल हैं। विशेष रूप से वुडबोरिंग बीटल में अधिकांश कोलोप्टरन कीड़े पौधों को खिलाते हैं, जिनमें से कई जंगलों और फलों के पेड़ों की महत्वपूर्ण कीट हैं, जिससे6पेड़ों को विनाशकारी नुकसान होता है। वर्तमान में, रासायनिक पारिस्थितिकी सिद्धांत पर आधारित कीटों की रोकथाम और नियंत्रण आबादी को बढ़ते ध्यान7प्राप्त हुए हैं । कुशल, कम विषैले, प्रदूषण मुक्त फेरोमोन नियंत्रण विधियां 8 का एक प्रभावीतरीकाबन गई हैं । सेंसिला आकृति विज्ञान और कीड़ों के अल्ट्रास्ट्रक्चर का अध्ययन कीट रासायनिक पारिस्थितिकी अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है। स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम और टीईएम, क्रमशः) का उपयोग उनकी आकृति विज्ञान और आंतरिक शरीर रचना विज्ञान का अध्ययन करने के लिए काफी प्रभाव के लिए किया जाता है। हालांकि, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) के लिए कीट के नमूने तैयार करने के दौरान, अवलोकन स्थल की वस्तुनिष्ठता और प्रामाणिकता9प्रभावित हो सकती है। सामान्य तौर पर, कीड़ों के एसईएम नमूना तैयार करने के लिए सफाई, ऊतक निर्धारण, निर्जलीकरण, मेटाथेसिस, सुखाने और स्पटर-कोटिंग10की आवश्यकता होती है। जटिल वातावरण के कारण जिसमें वुडबोरिंग बीटल रहते हैं, शरीर की सतह में अक्सर विभिन्न प्रदूषक होते हैं और उनके उपांगों में अक्सर कई ठीक लंबे सेंसिला या ब्रिस्टल होते हैं। विशेष रूप से, कुछ वुडबोरप्रयोगशाला स्थापना से उपलब्ध नहीं हैं, जो सीधे क्षेत्र में एकत्र होते हैं, और फिर ताजगी सुनिश्चित करने के लिए तरल पदार्थ को ठीक करने में डालते हैं और बाद में प्रयोगशाला में धोए जाते हैं। यदि नमूना पहले तय किया जाता है और फिर धोया जाता है, तो जाहिर है कि मलबे को हटाना बहुत अधिक कठिन है क्योंकि ग्लूटाराल्डिहाइड दृढ़ता से इसे नमूने में ठीक करता है। ट्वीन 20 एक सर्फेक्टेंट11,12,13,14है, जो धोने की प्रक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जिसमें पानी की सतह के तनाव को कम करना और कपड़े धोने की सतह पर पानी की गीलाता में सुधार करना शामिल है। इस अध्ययन में, ट्वीन 20 को तरल की सतह तनाव को कम करने के लिए फिक्सिंग समाधान और पीबीएस सफाई समाधान में जोड़ा गया था, और गंदगी को वुडबोरिंग बीटल के शरीर की सतह पर जमा करने से रोकता था, जिसने एसईएम में शरीर की सतह को क्लीनर बना दिया।
TEM का उपयोग करना, कीड़ों के विभिन्न अंगों पर सेंसिला को उनके अंदर स्पष्ट संरचनाओं को प्रकट करने के लिए कटा हुआ किया जा सकता है, इस प्रकार सेंसिला कार्यों का विश्लेषण करने के लिए एक आधार प्रदान करता है। जब लकड़ी की बीटल जैसे विषय कीट बड़ी होती है, और इसके शरीर की दीवार में स्क्लेरोटाइजेशन की पर्याप्त मात्रा होती है, इसलिए फिक्सिव कीट शरीर के अंदर अंग ऊतकों को पूरी तरह से संतृप्त नहीं कर सकता है। ट्वीन 20 गंदगी के फैलाव और निलंबन क्षमता को बढ़ा सकता है। इस अध्ययन में, ट्वीन 20 को वुडबोरिंग बीटल की कीट शरीर की दीवार में फिक्सेटिव द्रव प्रवेश को बढ़ाने के लिए फिक्सेटिव में जोड़ा गया था, जो एपिडर्मी11,12,13के विरूपण और पतन से बचता था। इसके अलावा, सामान्य टुकड़ा करने की तकनीक का उपयोग करके, विशेष रूप से कुछ छोटे सेंसिला15के लिए विभिन्न प्रकार के सेंसिला का सही पता लगाना मुश्किल है। पारंपरिक टेम नमूना तैयारी के आधार पर, इस अध्ययन ने एम्बेडेड ब्लॉक में कीट सेंसिला की स्थिति निर्धारित करने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और एसईएम को संयुक्त किया, इस प्रकार टुकड़ा करने की सटीकता में सुधार हुआ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस लेख में, हमने वुडबोरिंग बीटल के लिए स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए एक नमूना तैयारी योजना प्रस्तुत की। एक प्रतिनिधि अध्ययन विषय के रूप में कीट उपांग का उपयोग करना, हमने पारं?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम बीजिंग वोकेशनल कॉलेज ऑफ एग्रीकल्चर की उदार सहायता की सराहना करते हैं, परमाणु ऊर्जा के आवेदन के लिए संस्थान (कृषि विज्ञान की चीनी अकादमी), बीजिंग वानिकी विश्वविद्यालय के जैव अनुसंधान केंद्र और प्रोफेसर शान-गन जूलॉजी संस्थान, चाइनीज एकेडमी ऑफ साइंसेज की झांग । इस शोध को चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2017YFD0600103), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 31570643, 81774015), चीन के लोक कल्याण में वन वैज्ञानिक अनुसंधान (201504304), इनर मंगोलिया द्वारा समर्थित किया गया था कृषि विश्वविद्यालय उच्च स्तरीय प्रतिभा अनुसंधान स्टार्टअप योजना (203206038), और इनर मंगोलिया स्वायत्त क्षेत्र उच्च शिक्षा अनुसंधान परियोजना (NJZZ18047), इनर मंगोलिया स्वायत्त क्षेत्र Linxue “डबल प्रथम श्रेणी” निर्माण परियोजना (170001)।
Materials
| Anatomical lens | Chongqing Auto Optical limited liability company |
1425277 | |
| Carbon adhesive tape | SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc. | 7311 | |
| Carbon tetrachloride | Sigma | 56-23-5 | |
| Copper grids | GilderGrids | G300 | |
| Disodium hydrogen phosphate | Sinopharm group chemical reagent co., LTD | 10039-32-4 | |
| Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
| Flat embedding molds | Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | 70900 | |
| Fluorescence microscope | LEICA | DM2500 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | Anhydrous EM Grade |
| Isophorone | Sigma | 78-59-1 | |
| Lead citrate | Sigma | 512-26-5 | |
| Methanol | Sigma | 67-56-1 | |
| Monobasic sodium phosphate | Its group chemical reagent co., LTD | 7558-80-7 | |
| Objective micrometer | Olympus | 0-001-034 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 541-09-3 | |
| Petri dish | Aldrich | 1998 | |
| Razor blade | Gillette | ||
| Resin | Spurr | ERL4221 | |
| Scalpel | Lianhui | GB/T19001-2008 | |
| SEM | Hitachi | S-3400 | |
| Silica gel desiccant | Suzhou Longhui Desiccant Co., Ltd. | 112926-00-8 | |
| Small brush | Martol | G1220 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sputter ion instrument | Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Japan | E-1010 | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 HD | |
| TEM | Hitachi | H-7500 | |
| Tween 20 | Tianjin Damao Chemical Reagent | 9005-64-5 | |
| Ultramicrotome | Leica | UC6 | |
| Ultrasonic cleaner | GT Sonic | GT-X1 | |
| Uranyl acetate | Sigma | 6159-44-0 |
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