優れた眼溝の動脈分布胚発生中に可視化
Summary
ここでは、標準化された一連の優れた眼溝を観察するプロトコルを提案する脊椎動物の目で最近識別される、進化的に保存されている構造。ゼブラフィッシュ幼虫を用いて形成と眼肺尖の閉鎖に寄与する要因を識別するために必要な技術を示します。
Abstract
先天性眼のコロボーマは、通常不完全な脈絡裂閉鎖に起因する目の下面に裂として注目されている遺伝的疾患です。最近、虹彩、網膜、小説構造の発見につながったレンズの優れた側面に欠損を持つ個人の識別と呼ばれる優れた裂または一過性の背側に存在する優れた眼溝 (SOS)、脊椎動物の目の開発中に光カップの側面。この構造体は、マウス、ニワトリ、魚、イモリを渡って節約は、SOS の私達の現在の理解は限られています。その形成と閉鎖に寄与する要因を解明するためにそれを観察し、SOS の閉鎖の遅れなど、異常を識別することができることが不可欠です。ここでは、私たちは標準化された一連の免疫蛍光染色や mRNA など一般的な分子生物学の技術で広く利用可能な顕微鏡技術を組み合わせることで効率的に SOS を視覚化するために使用できるプロトコルを作成に着手します。過剰発現。この一連のプロトコルは SOS 閉鎖の遅延を観察する能力に焦点を当てて、それは実験者のニーズに適応可能であるし、簡単に変更することができます。全体的に、我々 はを通じて、脊椎動物の目の開発の現在の知識を展開する SOS の私達の理解を進めることができる親しみやすいメソッドを作成してほしい。
Introduction
脊椎動物の目の形成は、注意深く管弦楽に編曲された細胞間シグナル伝達経路が組織の種類を確立し、地域のアイデンティティ1指定の非常に節約されたプロセスです。眼の形態形成に対する摂動論に重大な欠陥に目のアーキテクチャと2まばゆいばかりの頻繁。1 つのような病気は眼杯3の腹側で脈絡眼裂を閉じます失敗に起因します。眼のコロボーマとして知られる、この障害は 4 5000 出生数と目4の中央に瞳孔から下方に突き出ている鍵穴のような構造としてけんしょう一般、小児失明の原因 3 11% から 1 で発生すると推定されます。 5,6。脈絡裂の機能は、後に割れ目の両側が船7を囲むヒューズ光カップに成長初期の血管のエントリ ポイントを提供することです。
眼のコロボーマは、古代から知られている中、目のスーペリアー/背側面に影響を与える組織の損失を最近小説欠損の患者のサブセットを同定しました。私たちの研究室の最近の研究は、我々 は優れた眼溝 (SOS) または上裂8として参照するゼブラフィッシュの背の眼の眼の構造の発見につながっています。構造が溝と割れ目の両方の特性を持っていることに注意してくださいすることが重要です。溝と同様に、鼻腔から一時的な網膜にまたがる継続的な組織の層です。さらに、構造の閉鎖しない基底膜に反対の 2 つの融合による、細胞により、構造が読み込まれます形成プロセスを要求する表示。ただし、割れ目と同様に、それは形作る基底膜と背の眼の鼻および時間的な側面を分離するという構造。一貫性を保つのため我々 が参照してくださいそれを SOS としてこのテキストで。
SOS は脊椎動物、魚、ニワトリ、イモリ、マウス8眼の形態形成時に見え間で保存されました。20 〜 60 時間後受精 (hpf) ゼブラフィッシュから存在する脈絡裂と対照をなして SOS 高速な過渡 20 23 hpf から簡単に見えること、欠席 26 hpf8で。当研究室における最近の研究は、脈絡裂と同様に、SOS 役割を果たしている目形態8血管ガイドで発見しました。形成と SOS の閉鎖を制御する要因は、まだ完全に理解されていないが我々 のデータはパターン化する遺伝子8背腹目の役割を強調しました。
ゼブラフィッシュは、SOS を研究する優秀なモデル生物であります。モデル システムとしていくつかの目の開発を勉強の利点を提供します: それは脊椎動物のモデル;各世代展示クマネズ (~ 200 胚);そのゲノム配列されている完全に、遺伝的操作を容易にします。ヒトの遺伝子の約 70% があることを人間の病気9,10の理想的な遺伝学に基づくモデルに少なくとも 1 つのゼブラフィッシュ細胞。最も重要なは、その開発が行われる外部から母親とその幼虫は透過的、相対的な容易さ11開発の目の可視化が可能です。
この一連のプロトコルでは、ゼブラフィッシュの幼虫で、SOS を視覚化できる手法について述べる。このレポートで使用されている可視化技術のさまざまなは、通常目の開発中に SOS の明確な観測だけでなく、SOS 閉鎖欠陥を検出する能力になります。Gdf6 の調査を特色にする私達の例のプロトコル、BMP は、背側にローカライズされた目と SOS 閉鎖の知られているレギュレータ。さらに、これらの技術は、遺伝的要因や適切な SOS 形成と開閉口挙動に影響を与える薬剤を識別する実験的操作と組み合わせることができます。さらに、我々 含まれている、すべての細胞膜の蛍光イメージングが可能、プロトコル SOS を周囲の細胞形態学的変化を観察する実験者を許可します。私たちの目標は、この新規開発の目の構造に新たな洞察を提供する科学のコミュニティで使用できる標準化されたプロトコルの設定を確立することです。
Protocol
Representative Results
Discussion
ゼブラフィッシュ胚の SOS を観察するプロトコルの標準化されたシリーズを紹介します。閉鎖遅延表現型を決定するには、私達のプロトコルが脈絡裂閉鎖遅延を可視化するための技術と同様、目の背側鼻と時空間背側の側面の 2 つの離散葉の分離を区別する能力に焦点を当てています。腹側の目の表現型。
これらの可視化技術は、抑制や SOS の閉鎖での役割を研究するあ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、カナダ研究所の健康研究 (機構)、自然科学と工学研究会 (レベル)、アルバータ州の革新技術先物と女性と子供の健康研究所 (WCHRI) によって支えられました。
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea | Sigma Aldrich | P7629-10G | |
| 100 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 35 mm Petri dish | Corning | CLS430588 | |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | AGA001.1 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| DIC/Fluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z1 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX12 | |
| Dissection microscope camera | Qimaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Dow Corning High-vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma Aldrich | A5040-25G | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Image capture software | Zeiss | ZEN | |
| Incubator | VWR | Model 1545 | |
| Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Minutien pin | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148-500G | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 | Fisher Scientific | BP1752-100 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P4850 | |
| Rabbit anti-laminin antibody | Millipore Sigma | L9393 | |
| TURBO Dnase (2 U/µL) | Invitrogen | AM2238 | |
| Ultrapure low-melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525017 |
References
- Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).
- Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
- Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
- Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E. Ocular colobomata. Survey of Ophthalmolgy. 45, 175-194 (2000).
- Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
- Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
- Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
- Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).
- Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).
