Danio rerio Embryogenesis 동안 우수한 눈 고 랑의 시각화
Summary
여기, 우리 제시 우수한 눈 고 랑을 관찰 하는 프로토콜의 표준화 된 시리즈 척추 눈에서 최근 발견, 진화론 보존 구조. Zebrafish 애벌레를 사용 하 여, 형성 및 우수한 눈 고 랑의 폐쇄에 기여 하는 요소를 식별 하는 데 필요한 기술을 설명 합니다.
Abstract
선 천 성 안구 coloboma 불완전 한 맥락 막 게 폐쇄에서 발생 하는 눈의 열 등 한 측면에서 분열으로 일반적으로 관찰 되는 유전 질환 이다. 최근, 홍 채, 망막, 및 비 발한 구조의 발견에 지도 하는 렌즈의 우수한 측면에서 coloboma 개인의 식별 이라고 뛰어난 균열 또는 우수한 눈 고 랑 (SOS)는 지 느 러 미에 뚜렷이 존재 하는 척추 동물 눈 개발 시 컵의 측면. 이 구조는 쥐, 병아리, 물고기, 그리고 영원에 걸쳐 보존은, 비록 SOS의 우리의 현재 이해는 제한 됩니다. 그것의 형성 및 폐쇄에 기여 하는 요인, 명료 하 게 하기 위해 그것을 관찰 하 고 이상이, SOS의 폐쇄에 지연 등 식별 수 필수적입니다. 여기, 우리 immunofluorescent 얼룩 및 mRNA와 같은 일반적인 분자 생물학 기술로 널리 현미경 기술을 결합 하 여 SOS를 효율적으로 시각화를 사용할 수 있는 프로토콜의 표준화 된 시리즈를 만들 밖으로 설정 overexpression입니다. 프로토콜의이 세트는 SOS 폐쇄 지연 관찰 하는 능력에 초점을 맞추고, 하는 동안 실험의 요구에 적응할 수 있는 하 고 쉽게 수정할 수 있습니다. 전반적으로, 친근 한 메서드는 SOS의 우리의 이해 척추 눈 개발의 현재 지식을 확장을 고급 수를 만드는 노력 하겠습니다.
Introduction
척추 동물 눈의 형성 과정이 매우 보존는 신중 하 게 조율 된 세포 신호 경로 조직 유형을 설정 하 고 지정 지역 정체성1. 초기 눈 morphogenesis 하 섭 눈의 아키텍처를 깊은 결함 귀착되 고2눈부신 자주 있다. 같은 하나의 질병 시 컵3의 복 부 측에 맥락 막 눈 균열을 실패에서 유래한 다. 눈 coloboma로 알려진이 장애 4-5000 라이브 출생 및 일반적으로 inferiorly 눈4의 중심에 있는 눈동자에서 돌출 하는 열쇠 구멍 모양의 구조로 만들어 낸 소아 실명의 원인 3-11 %1 발생 추정 5,6. 맥락 막 균열의 기능은 후는 균열의 측면 혈관7을 묶는 데 융합 것입니다 시 컵에 성장 초기 맥 관 구조에 대 한 진입점을 제공 하는 것 이다.
눈 coloboma은 고 대부터 알려져 왔다, 하는 동안 우리가 최근 눈의 우수한/등 쪽 측면에 영향을 미치는 조직 손실 coloboma 환자의 소설 부분 집합을 확인 했습니다. 우리 실험실에서 최근 작품 지칭 우수한 눈 고 랑 (SOS) 또는 뛰어난 균열8zebrafish 등 눈에는 눈 구조의 발견을 주도하 고 있다. 구조는 고 랑과는 균열의 특성은 중요 하다. 한 고 랑 마찬가지로 그것은 비음에서 일시적인 망막에 걸쳐 지속적인 조직 계층입니다. 또한, 구조의 폐쇄는 반대 하는 지하실 막, 2의 융합에 의해 중재 하지 고 전체적 프로세스는 구조는 세포에 의해 채워집니다를 나타납니다. 그러나,는 게와 마찬가지로, 그것은 지하실 막 등 눈의 비 강 및 시간적 측면을 구분 하는 구조 형성. 일관성을 위해 우리는 참조할 SOS로이 텍스트에서.
SOS는 진화론 척추 동물, 물고기, 병아리, 영원, 및 마우스8눈 morphogenesis 동안 표시 되 고에서 보존 됩니다. Zebrafish에 20-60 시간 후 수정 (hpf)에서 존재 하는 맥락 막 게 달리 SOS 매우 과도 20-23 hpf에서 쉽게 볼 수 되 고 결 석 26 hpf8. 우리 실험실에서 최근 연구는, 비슷한 맥락 막 균열, SOS 역할 눈 morphogenesis8동안 혈관 가이드에 발견 했다. 형성 및 SOS의 폐쇄를 제어 하는 요소는 아직 완전히 이해 되지 않습니다, 하지만 우리의 데이터 패턴화 유전자8등 복 부 눈에 대 한 역할 강조 했다.
Zebrafish는 SOS를 공부 하는 우수한 모델 생물 이다. 모델 시스템으로 공부 눈 개발에 장점을 제공 합니다: 그것은 척 추가 있는 모델; 각 세대 전시 높은 통치 (~ 200 배아); 그것의 게놈 완전 시퀀싱 된 유전자 조작;를 용이 하 게 그리고 인간의 유전자의 약 70% 이상의 zebrafish orthologue, 그것은 인간의 질병9,10의 이상적인 유전학 기반 모델을 만드는. 가장 중요 한 것은, 그것의 개발 외부 어머니, 그리고 그것의 애벌레는 투명, 쉽게11와 개발 눈의 시각화에 대 한 수 있습니다.
프로토콜의이 세트에서 우리는 SOS zebrafish 애벌레에 구상 될 수 있다 기술을 설명 합니다. 이 보고서에 사용 되는 시각화 기법의 다양 한 정상적인 눈 개발 하는 동안 SOS의 명확한 관측 뿐만 아니라 SOS 폐쇄 결함을 감지 하는 능력 수 있습니다. 우리의 예제에서는 프로토콜 Gdf6의 조사 기능을 한다는 BMP는 등 지역화 눈과 SOS 폐쇄의 알려진된 레 귤 레이 터. 또한, 이러한 기술은 유전적 요인 또는 약리 에이전트에 적절 한 조 난 신호 형성 및 폐쇄에 영향을 식별 하는 실험 조작 결합 될 수 있다. 또한, SOS를 주변 세포를 형태학 상 변화를 관찰 하는 실험을 수 있도록 프로토콜을 통해 모든 세포 막의 형광 이미징이 가능, 포함 시켰습니다. 우리의 목표는 개발 눈의이 소설 구조에 새로운 통찰력을 제공 하는 과학적 사회 전반에 걸쳐 사용할 수 있는 표준화 된 프로토콜의 집합을 설정 하는.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 선물이 발전 zebrafish 태아에서 조 난 신호를 관찰 하는 프로토콜의 표준화 된 시리즈. 확인 하려면 폐쇄 지연 고기, 우리의 프로토콜에 초점을 맞춘 눈, 비슷한 맥락 막 게 폐쇄 지연 시각화 하는 데 사용 하는 기술을의 지 강과 등 시간적 측면의 두 개의 개별 돌출부의 분리를 구별할 수 있는 능력 복 부 눈에 고기입니다.
이러한 시각화 기술은 SOS의 폐쇄에 그들의 역할을 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR), 자연과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC), 앨버타 혁신 기술 선물, 그리고 여 성과 어린이 건강 연구 연구소 (WCHRI)에 의해 지원 되었다.
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea | Sigma Aldrich | P7629-10G | |
| 100 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 35 mm Petri dish | Corning | CLS430588 | |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | AGA001.1 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| DIC/Fluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z1 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX12 | |
| Dissection microscope camera | Qimaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Dow Corning High-vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma Aldrich | A5040-25G | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Image capture software | Zeiss | ZEN | |
| Incubator | VWR | Model 1545 | |
| Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Minutien pin | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148-500G | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 | Fisher Scientific | BP1752-100 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P4850 | |
| Rabbit anti-laminin antibody | Millipore Sigma | L9393 | |
| TURBO Dnase (2 U/µL) | Invitrogen | AM2238 | |
| Ultrapure low-melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525017 |
References
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