Visualisering av Superior okulär Sulcus under Danio rerio embryogenes
Summary
Här presenterar vi en standardiserad serie av protokoll att iaktta den överlägsna okulära sulcus, en nyligen identifierade, evolutionärt bevarade struktur i ryggradsdjur öga. Med Zebrafiskar larver, demonstrerar vi tekniker behövs för att identifiera faktorer som bidrar till bildning och stängning av den överlägsna okulära sulcus.
Abstract
Medfödd okulär coloboma är en genetisk sjukdom som observeras vanligtvis som en skreva i sämre aspekt av ögat följd av ofullständig koroidea fissur stängning. Nyligen, identifiering av individer med coloboma i överlägsen aspekten av iris, näthinnan och linsen som ledde till upptäckten av en ny struktur, kallad den överlägsna spricka eller överlägsen okulär sulcus (SOS), som tillfälligt finns på den dorsala aspekt av optic cup under ryggradsdjur öga utveckling. Även om denna struktur är bevarad över möss, chick, fisk och newt, är vår nuvarande förståelse av SOS begränsad. För att belysa faktorer som bidrar till dess bildande och nedläggning, är det absolut nödvändigt för att kunna följa det och identifiera avvikelser, såsom fördröjning i stängningen av SOS. Här, syftar vi till att skapa en standardiserad serie av protokoll som kan användas för att effektivt visualisera SOS genom att kombinera allmänt tillgängliga mikroskopi tekniker med gemensamma molekylärbiologiska tekniker såsom Immunofluorescerande färgning och mRNA överuttryck. Medan denna uppsättning protokoll är inriktad på förmågan att iaktta SOS stängningen försening, det är anpassningsbar till de experimenter’s behov och kan enkelt ändras. Sammantaget hoppas vi skapa en lättillgänglig metod genom vilken vår förståelse av SOS kan föras fram för att expandera den aktuella kunskapen om ryggradsdjur öga utveckling.
Introduction
Bildandet av vertebrate ögat är en mycket process där noggrant iscensatta intercellulära signalvägar upprätta vävnadstyper och ange regional identitet1. Störningar till tidig ögat morfogenes resultera i djupa defekter till arkitekturen i ögat och är ofta bländande2. En sådan sjukdom resulterar från underlåtenhet att stänga den koroidea okulära sprickan i ventrala sida av optic cup3. Denna sjukdom, som kallas okulär coloboma, uppskattas förekomma hos 1 av 4-5000 levande födda och orsak 3-11% av pediatrisk blindhet, ofta manifesterar sig som ett nyckelhål-liknande struktur som sticker ut inferiorly från eleven i mitten av ögat4, 5,6. Funktionen av koroidea spricka är att ge en startpunkt för tidig vaskulatur växer i optic koppen, varefter sidorna av sprickan kommer säkring för att innesluta den fartyg7.
Medan okulär coloboma har varit känt sedan urminnes tider, har vi nyligen identifierat en roman delmängd av coloboma patienter med vävnad förlust påverkar den superior/dorsala aspekten av ögat. Senaste arbete i vårt labb har lett till upptäckten av en okulär struktur i Zebrafiskar dorsala ögat, som vi kallar den överlägsna okulär sulcus (SOS) eller överlägsna spricka8. Det är viktigt att notera att strukturen har egenskaper från både en sulcus och en spricka. Liknar en sulcus, det är en kontinuerlig vävnad skikt som spänner från nässlemhinnan på tidsmässiga näthinnan. Dessutom stängningen av strukturen är inte medieras av en fusion av de två motsatta basalmembranet, och det verkar kräva en morphogenetic process genom vilken struktur är befolkad av celler. Dock liknar en spricka, det bildar en struktur som skiljer nasal och tidsmässiga sidorna av dorsala ögat med basalmembranet. För konsekvens hänvisar vi till det som SOS i denna text.
SOS är evolutionärt bevarad över ryggradsdjur, att vara synlig under ögat morfogenes i fisk, chick, newt och mus8. I motsats till den koroidea spricka, som finns från 20-60 timmar efter befruktning (hpf) i Zebrafiskar, SOS är mycket övergående, lätt synlig från 20-23 hpf och frånvarande av 26 hpf8. Senare forskning i vårt labb har funnit att, liknar den koroidea sprickan, SOS spelar en roll i vaskulär vägledning under ögat morfogenes8. Även om de faktorer som styr bildandet och nedläggning av SOS inte är ännu helt klarlagda, våra data Markera roller för dorsal-ventrala öga mönstring gener8.
Zebrafisk är en utmärkt modellorganism att studera SOS. Som modellsystem, det ger ett antal fördelar i att studera ögats utveckling: det är en vertebrate modell; varje generation uppvisar hög fruktsamhet (~ 200 embryon). dess arvsmassa har varit fullt sekvenserade, vilket underlättar genetisk manipulation; och cirka 70% av mänskliga gener har minst en Zebrafiskar orthologue, vilket gör det till en idealisk genetik-baserad modell av mänskliga sjukdomar9,10. Viktigast av allt, dess utveckling sker externt till mamman, och dess larver är transparenta, vilket möjliggör visualisering av utveckla ögat med relativ lätthet11.
I denna uppsättning protokoll beskriver vi de metoder genom vilka SOS kan visualiseras i Zebrafiskar larver. Olika visualiseringstekniker som används i denna rapport gör att tydlig observation av SOS under normala ögats utveckling, liksom förmågan att upptäcka SOS stängning defekter. Våra exempel protokoll kommer att innehålla undersökningar av Gdf6, BMP lokaliserad till den dorsala öga och kända regulator av SOS nedläggning. Ytterligare, dessa tekniker kan kombineras med experimentella manipulationer för att identifiera genetiska faktorer eller farmakologiska medel som påverkar korrekt SOS bildandet och stängning. Vi har dessutom inkluderat ett protokoll genom vilket den fluorescerande avbildning av alla cellmembran är möjligt, att låta försöksledaren att iaktta morfologiska förändringar i celler som omger SOS. Vårt mål är att fastställa en uppsättning standardiserade protokoll som kan användas i hela det vetenskapliga samfundet för att erbjuda nya insikter i denna nya struktur i utvecklingsländer ögat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här presenterar vi en standardiserad serie av protokoll att följa SOS i det växande embryot Zebrafiskar. För att avgöra stängningen försening fenotyper, har våra protokoll fokuserat på förmågan att särskilja separation av två diskreta lober av dorsala-nasala och dorsal-temporal sidor av ögat, liknande tekniker används för att visualisera koroidea fissur stängningen försening fenotyper i ventrala ögat.
Dessa visualiseringstekniker kan användas tillsammans med en mängd genet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av kanadensiska institut för hälsa forskning (CIHR), naturliga vetenskaper och Engineering Research rådet (NSERC), Alberta utvecklar teknik Futures, och kvinnor och barns hälsa Research Institute (WCHRI).
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea | Sigma Aldrich | P7629-10G | |
| 100 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 35 mm Petri dish | Corning | CLS430588 | |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | AGA001.1 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| DIC/Fluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z1 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX12 | |
| Dissection microscope camera | Qimaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Dow Corning High-vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma Aldrich | A5040-25G | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Image capture software | Zeiss | ZEN | |
| Incubator | VWR | Model 1545 | |
| Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Minutien pin | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148-500G | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 | Fisher Scientific | BP1752-100 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P4850 | |
| Rabbit anti-laminin antibody | Millipore Sigma | L9393 | |
| TURBO Dnase (2 U/µL) | Invitrogen | AM2238 | |
| Ultrapure low-melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525017 |
References
- Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).
- Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
- Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
- Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E. Ocular colobomata. Survey of Ophthalmolgy. 45, 175-194 (2000).
- Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
- Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
- Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
- Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).
- Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).
