משלוח אלקטרופסטי לγ-חומצה עמינח בוטירית (נגבה) לפוקוס אפילפטי מונע התקפים בעכברים
Summary
האתגר של מחקר אפילפסיה הוא לפתח טיפולים חדשניים עבור חולים שבהם הטיפול הקלאסי אינו מספיק. באמצעות פרוטוקול חדש-בעזרתו של מערכת העברת תרופות להשתלות-אנו מסוגלים לשלוט בהתקפים בעכברים מוחוקים על-ידי המסירה האלקטרופיניטית של נגבה לתוך המוקד האפילפטי.
Abstract
אפילפסיה היא קבוצה של הפרעות נוירולוגיות אשר משפיע על מיליוני אנשים ברחבי העולם. למרות שהטיפול בתרופות מועיל ב-70% מהמקרים, תופעות לוואי חמורות משפיעות על איכות החיים של המטופלים. יתר על כן, אחוז גבוה של חולים אפילפטי עמידים בפני סמים; במקרה שלהם, נוירוכירורגיה או גירוי נוירולוגי נחוצים. לכן, המטרה העיקרית של מחקר אפילפסיה היא לגלות טיפולים חדשים אשר מסוגלים לרפא אפילפסיה ללא תופעות לוואי או מניעת התקפים חוזרים בחולים עמידים בפני סמים. נוירוהנדסאים מספקת גישות חדשות באמצעות אסטרטגיות וטכנולוגיות הרומן כדי למצוא פתרונות טובים יותר לריפוי חולים אפילפטי בסיכון.
כהדגמה של פרוטוקול ניסיוני הרומן במודל העכבר החריף של אפילפסיה, מערכת ישירה של סמים באתרו האספקה החשמלית משמש. כלומר, בדיקה עצבית שילוב משאבת יון מיקרופלואידיסי (Μd) עבור מסירת סמים על פי דרישה והקלטה בו של פעילות עצבית מקומית מושתל והפגינו להיות מסוגל לשלוט 4-פמפרידין המושרה (4AP המושרה) תפיסה כמו פעילות אירוע. הריכוז הγ-עמינח של החומצה הבוטירית מוחזק בטווח הפיזיולוגי על ידי השליטה המדויקת של משלוח הנגבה כדי להגיע לאפקט אנטי-אפילפטי במוקד התפיסה, אך לא לגרום להתפרצויות של התפרצויות ריבאונד. השיטה מאפשרת הן זיהוי של פעילות פתולוגית והתערבות להפסיק התקפים על ידי אספקת נוירוטרנסמיטורים מעכבות ישירות המוקד אפילפטי עם שליטה מדויקת זמן.
כתוצאה מההתפתחויות לשיטה הניסיונית, ניתן להביא SLEs באופן מקומי מאוד המאפשר השתלטות על ידי משלוח בדיוק מכוון באמצעות מסירת התפיסה בתחילת ההתקף.
Introduction
אפילפסיה היא ההפרעה הנוירולוגית הרביעית הנפוצה ביותר: כ 1% מהאוכלוסייה סובלת מאפילפסיה, וכשליש מהמושפעות יש התקפים חוזרים. ברוב המקרים, התקפים יכולים להיות נשלט עם תרופות. עם זאת, טיפול בסמים צריך להיות מוגדר עבור כל מטופל בנפרד, שבו המינון הנכון יכול לקחת שנים כדי למצוא1,2. בנוסף, לרוב התרופות יש תופעות לוואי חמורות המקטינה את איכות החיים3,4,5,6,7. לבסוף, ב 30% מהחולים במקרים עמידים בפני תרופות, ובמקרה של מקור קבוע מחולל תפיסה אחת, רק כירורגי resective יכול להחליש את המופע של התקפים8. לכן, היוזמה העיקרית במחקר אפילפסיה המודרנית היא לגלות אסטרטגיות חדשות אשר יכולים למנוע התקפים חוזרים לחולים בסיכון, תוך הפחתת הצורך של טיפולים חזקים בתרופות וניתוחים פולשנית מחדש.
ויהיו אפילפסיה להתרחש כאשר יש חוסר איזון בתוך מעגלים המעכבות ושאיפה בכל רחבי המוח (אפילפסיה כללית) או בחלק מקומי של המוח (אפילפסיה מוקד), כך הנוירונים הפרשות בצורה נורמלית9 , מיכל עשור , 11. תרופות נוגדות אפילפסיה יכולות לפעול בשתי דרכים שונות במניעת תפיסה: הפחתת עירור או שיפור עיכוב12. באופן ספציפי, הם יכולים לשנות את פעילות החשמל של תאים עצביים על ידי השפעה על ערוצי יונים בתא קרום13 או לפעול על שידור כימי בין הנוירונים על ידי השפעה על הנוירוטרנסמיטר מעכבות נגבה או ההתרגשות גלוטמט ב הסינפסות14,15. עבור תרופות מסוימות, מצב הפעולה אינו ידוע18. כמו כן, טיפולים בתרופות יש השפעה רציפה על חולים ולא יכול להסתגל הדינמיקה השכיחות של התקפים. באופן אידיאלי, תרופות עם מנגנונים ספציפיים של פעולה יפעלו על התהליכים הבסיסיים אפילפסיה. טיפול אופטימלי לא ייגע באינטרפיקציה של המוח אך יפעל מיד כאשר התקף מתחיל להתפתח. בניגוד לכך, בכל המקרים של אפילפסיה, תרופות כיום משמעותה טיפול שיטתי, המשפיעים על המוח כולו ועל כל הגוף של החולה9.
התקפים אפילפטי יכולים להופיע שנים רבות לאחר העלבון הראשוני כגון טראומה מוחית. התקופה שבין העלבון הראשוני לבין התרחשות ההתקפים הספונטניים הראשונים מתאפיינת בארגונים מולקולריים וסלולאריים ניכרים, כולל מוות עצבי עם היעלמות חיבורי הרשת העצביים והאקאליות לבלוב/neosynaptogenesis עם הופעת קשרים חדשים19,20,21. פעם התקפים הופכים חוזרים, התדר שלהם ואת חומרת נוטים להגדיל, מעורבים באזורים המוח יותר. חשוב להבדיל בין האתרים של התפרצות התפיסה (אזורים epileptogenic) מרשתות הפצה, מאחר שכללי התפיסה הראשית וההפצה עשויים להיות שונים. מחקרים שבוצעו על רקמות האדם ומודלים ניסיוניים של אפילפסיה סיפקו נתונים חשובים לגבי התארגנות משנה של מעגלים ויכולתם לייצר התקפים20,21,22, 23. עם זאת, קשה לקבוע אם הארגונים האלה הם תגובות אדפטיבית או אם הם causally הקשורים epileptogenesis או להתקף בראשית והפצת12.
לכן, לוקליזציה של המוקד האפילפטי והחלת תרופות נוגדות אפילפסיה באופן מקומי הם אחד האתגרים העיקריים במחקר אפילפסיה עכשווית. מספר ניסויים באמצעות מודלים של בעלי חיים של אפילפסיה וכמה מחקרים קליניים שמטרתם למצוא את התחלתה של האירועים תפיסה ולהגדיר את המנגנונים הבסיסיים במוח24,25,26,27. למטרה זו, פיתחנו פרוטוקול ניסיוני חדש באמצעות המודל המושרה 4ap אפילפסיה28,29,30,31 ב הכנה לעכבר חריפה, אשר מאפשר הוספה מדויקת של שלושה התקנים לאזור נתון של ההיפוקמפוס, שבו פעילות הרשת ב vivo מניפולציות באופן מאוד מקומי. הזרקת 4AP מקומי על ידי מיקרופיפטה זכוכית מסייעת לגרום למחלת אפילפסיה במקום המותאם לשפות אחרות בהיפוקמפוס, בעוד בעזרת הרומן המבוסס על פולימר מבוססי לבדוק את השליטה בפעילות התפיסה מושגת בו על ידי הקלטת את האדם העצבי פעילות חשמלית עם אתרי ההקלטה של המכשיר. היפוקמאל פעילות השדה המקומי הוא גם מפוקח עם בדיקה סיליקון רב ערוצית באופן ספציפי לשכבה בקליפת ובהיפוקמפוס בו.
הבדיקות האחרונות Μi Fip פועלות באמצעות שדה חשמלי שהוחל על מנת לדחוף תרופות מוחסות המאוחסנות בערוץ microflu, לאורך קרום חילופי יונים (IEM) והחוצה אל הרקמה שמסביב (איור 1). ה-IEM מסיע סוג אחד בלבד של יון (קטיון או אניאון), ולכן פועל להגביל את הדיפוזיה הן במצב “off” והן בהובלה של מינים הטעונים באופן מקיף מהרקמה הסובבת לתוך המכשיר. השדה החשמלי נוצר על פי דרישה על ידי החלת מתח קטן (< 1 V) בין האלקטרודה המקור שהוא פנימי לערוץ microflu, האלקטרודה היעד שהוא חיצוני למכשיר (במקרה זה, בורג הראש על המודל של בעל חיים). קצב מסירת הסמים פרופורציונלי למתח המוחל ולזרם הנמדד בין אלקטרודות המקור והיעד. היכולת המדויקת של מסירת הסמים היא אחד היתרונות העיקריים של ה-μFIP. יתרון קריטי נוסף, לעומת פלואידיג או מערכות לאספקת סמים מבוססי לחץ, הוא כי ב-Μi יש רק להגדיל את הלחץ הזניח בשקע משלוח הסמים כמו סמים מועברים ברחבי IEM ללא פתרון הספק שלהם.
יש כמות קטנה של דליפה פסיבית של נגבה כאשר ה-Μpave הוא “off”, אבל זה נמצא לא להשפיע SLEs. ה-Μi הם מותאמים אישית בעקבות שיטות מיקרו-ייצור קונבנציונליות שדווחו קודם לכן ב-31.
מאז אחת הדרכים של מניעת התקפים חוזרים הוא המצור של הרשת פולט בתחילת מאוד או אפילו לפני אירוע התפיסה הראשונה, השיטה המוצגת לאספקת נוירוטרנסמיטר מעכבות נגבה לתוך המוקד אפילפטי יש הרבה פוטנציאל תרפויטי לשליטה בחולים עם אפילפסיה מוקד. מכיוון שנגבה היא מצע אנדודוגני, הוא מותיר תכונות נוירואליות פנימיות ללא שינוי בריכוזים פיזיולוגיים. היישום המקומי של רמות נמוכות של נגבה רק ישפיע על התאים הקשובים באופן טבעי לעיכוב, ויהיה רק לגרום לתופעות דומות לעיכוב פיזיולוגי, בניגוד לגירוי מוחי עמוק (DBS), שיש לו פעולות בלתי מדויקות על ידי עירור כל התאים של הרשת העצבית בסביבתו, וגרמה לתגובה מעורבת הכרוכה בעירור ובעיכוב. לסיכום, השיטה המוצעת מספקת גישה ספציפית יותר לתפיסת שליטה מאשר DBS.
Protocol
Representative Results
Discussion
על ידי פיתוח פרוטוקול ניסיוני חדש במודל העכבר חריפה של אפילפסיה, SLEs יכול להיות נשלט בהצלחה בעזרת הצפק Μi מושתל במוקד האפילפטי. הודות ליכולתה לספק את העבודה עם הדיוק הזמני והמרחב, המושרה 4AP SLEs שלטו בתחילתה של ההתקפים. טיפול במחלת האפילפסיה אפשרי תיאורטית אם השליטה על הפרשות הרשת העצבית מושג?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.M.P. מודה במימון המענק הבינלאומי של ויטאקר שמנוהל על ידי המכון לחינוך בינלאומי. A.K. בחסות מארי קירי (מס ‘ 625372). A.W. מודה במימון מועצת המחקר האירופית (ERC) תחת אופק 2020 תוכנית המחקר והחדשנות של האיחוד האירופי (הסכם הענקת מס ‘ 716867). A.W. בנוסף מכיר ביוזמת המצוינות של אוניברסיטת אקס-מרסיי-A * MIDEX, “הצרפתים” התוכנית של “מדעי הבית”. המחברים מכירים את ד ר אילקה Uguz, ד ר Sahika לאלה, ד ר וינצ Curto, ד ר מרי דונהיו, ד”ר מארק פרו, ו Zsófia Maglóczky על השתתפותם בדיונים פוריים.
Materials
| 4AP | Sigma | 275875 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab15007 | |
| Amplifier | Neuralynx, Montana, USA | Digital Lynx 4SX | |
| Amplifier | Ampliplex | KJE-1001 | |
| Atlas Stereotaxique | Allen Atlas | 978-0470054086 | |
| Borosilica glass pipette | Sutter | BF120-69-15 | |
| Brain Matrix | WPI | RBMA-200C | |
| Bone trimmer | FST | 16109-14 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Connector | INSTECH | SC20/15 | |
| Coton tige | Monoprix | EMD 6107OD | |
| Cover slip | Menzel-Glass | 15747592 | |
| DiI Stain | Thermo Fisher | D282 | |
| DMSO | Sigma | 11412-11 | |
| Drill | FOREDOM | K1070 | |
| Forceps | F.S.T. | 11412-11 | |
| GABA | Sigma | A2129 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | Thermofisher | 53-9892-80 | |
| GOPS | Sigma | 440167-100M | |
| Hamilton seringe | Hamilton | 80330 | |
| Headscrew | Component Supply | TX00-2FH | |
| Heating pad | Harvard apparatus | 341446 | |
| Injection Pump | WPI | UMP3-3 | |
| Keithley | Tektoronix | 216A | |
| Ketamine | Renaudin | 5787419 | |
| Magnetic holder | Narishige | GJ-1 | |
| Mice | Charles River | 612 | |
| Motoric manipulator | Scientifica, UK | IVM | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 7558807 | |
| NeuroTrace DiI | Thermofisher | N22880 | |
| Paper towel | KIMBERLY CLARK | 7552000 | |
| PB | Sigma | P4417 | |
| PEDOT:PSS | CLEVIOS | 81076212 | |
| PFA | Acros Organic | 30525-89-4 | |
| Rectal temperature probe | Harvard apparatus | 521591 | |
| Ropivacaine | KABI | 1260216 | |
| Saline | Sigma | 7982 | |
| Scalpel | F.S.T | AUST R195806 | |
| Seringue | BD Medical | 324826 | |
| Serrefine clamp | F.S.T | 18050-28 | 4 is recommended |
| Silicon probe | NeuroNexus, Michigan, USA | A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703 | |
| Stereotoxic frame | Stoelting | 51733U | |
| Superfrost Slide | ThermoScientific | J38000AMNZ | |
| Tubing | INSTECH | LS20 | |
| Vaseline | Laboratoire Gilbert | 3518646126611 | |
| Vectashield DAPI | Vector Laboratories, California, USA | H-1200-10 | |
| Vibratome, Leica VT1200S | Leica Microsystems | 1491200S001 | |
| Xylazine | Bayer | 4007221032311 |
References
- Kwan, P., Palmini, A. Association between switching antiepileptic drug products and healthcare utilization: A systematic review. Epilepsy & Behavior. 73, 166-172 (2017).
- Belleudi, V., et al. Studies on drug switchability showed heterogeneity in methodological approaches: a scoping review. Journal of Clinical Epidemiology. 101, 5-16 (2018).
- Chen, B., et al. Psychiatric and behavioral side effects of antiepileptic drugs in adults with epilepsy. Epilepsy & Behavior. 76, 24-31 (2017).
- Brodie, M. J., et al. Epilepsy, Antiepileptic Drugs, and Aggression: An Evidence-Based Review. Pharmacological Reviews. 68 (3), 563-602 (2016).
- Hamed, S. A. The auditory and vestibular toxicities induced by antiepileptic drugs. Expert Opinion on Drug Safety. 16 (11), 1281-1294 (2017).
- Hamed, S. A. The effect of epilepsy and antiepileptic drugs on sexual, reproductive and gonadal health of adults with epilepsy. Expert Review of Clinical Pharmacology. 9 (6), 807-819 (2016).
- Roff Hilton, E. J., Hosking, S. L., Betts, T. I. M. The effect of antiepileptic drugs on visual performance. Seizure. 13 (2), 113-128 (2004).
- Stafstrom, C. E., Carmant, L. Seizures and epilepsy: an overview for neuroscientists. Cold Spring Harbor Perspective in Medicine. 5 (6), (2015).
- Arzimanoglou, A., et al. A Review of the New Antiepileptic Drugs for Focal-Onset Seizures in Pediatrics: Role of Extrapolation. Paediatric Drugs. 20 (3), 249-264 (2018).
- Avoli, M., et al. Specific imbalance of excitatory/inhibitory signaling establishes seizure onset pattern in temporal lobe epilepsy. Journal of Neurophysiology. 115 (6), 3229-3237 (2016).
- Badawy, R. A., Freestone, D. R., Lai, A., Cook, M. J. Epilepsy: Ever-changing states of cortical excitability. 신경과학. 222, 89-99 (2012).
- Loscher, W., Brandt, C. Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
- Porter, R. J. Mechanisms of action of new antiepileptic drugs. Epilepsia. 30, (1989).
- Rogawski, M. A. Diverse mechanisms of antiepileptic drugs in the development pipeline. Epilepsy Research. 69 (3), 273-294 (2006).
- Czapinski, P., Blaszczyk, B., Czuczwar, S. J. Mechanisms of action of antiepileptic drugs. Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (1), 3-14 (2005).
- Ye, H., Kaszuba, S. Inhibitory or excitatory? Optogenetic interrogation of the functional roles of GABAergic interneurons in epileptogenesis. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 93 (2017).
- Loscher, W., Klitgaard, H., Twyman, R. E., Schmidt, D. New avenues for anti-epileptic drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (10), 757-776 (2013).
- Manchishi, S. M. Recent Advances in Antiepileptic Herbal Medicine. Current Neuropharmacology. 16 (1), 79-83 (2018).
- Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
- Cohen, I., Navarro, V., Clemenceau, S., Baulac, M., Miles, R. On the origin of interictal activity in human temporal lobe epilepsy in vitro. Science. 298 (5597), 1418-1421 (2002).
- Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nature Neuroscience. 14 (5), 627-634 (2011).
- Bui, A., Kim, H. K., Maroso, M., Soltesz, I. Microcircuits in Epilepsy: Heterogeneity and Hub Cells in Network Synchronization. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 5 (11), (2015).
- Prince, D. A., Gu, F., Parada, I. Antiepileptogenic repair of excitatory and inhibitory synaptic connectivity after neocortical trauma. Progress in Brain Research. 226, 209-227 (2016).
- Nilsen, K. E., Cock, H. R. Focal treatment for refractory epilepsy: hope for the future. Brain Research: Brain Research Reviews. 44 (2-3), 141-153 (2004).
- Martinkovic, L., Hecimovic, H., Sulc, V., Marecek, R., Marusic, P. Modern techniques of epileptic focus localization. International Review of Neurobiology. 114, 245-278 (2014).
- Nagaraj, V., et al. Future of seizure prediction and intervention: closing the loop. Journal of Clinical Neurophysiology. 32 (3), 194-206 (2015).
- Osman, G. M., Araujo, D. F., Maciel, C. B. Ictal Interictal Continuum Patterns. Current Treatment Options in Neurology. 20 (5), 15 (2018).
- Slezia, A., et al. Uridine release during aminopyridine-induced epilepsy. Neurobiology of Disease. 16 (3), 490-499 (2004).
- Baranyi, A., Feher, O. Convulsive effects of 3-aminopyridine on cortical neurones. Electroencephalography Clinical Neurophysiology. 47 (6), 745-751 (1979).
- Szente, M., Baranyi, A. Mechanism of aminopyridine-induced ictal seizure activity in the cat neocortex. Brain Research. 413 (2), 368-373 (1987).
- Proctor, C. M., et al. Electrophoretic drug delivery for seizure control. Science Advances. 4 (8), eaau1291 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . Paxinos and Franklin’s the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates Fourth Edition. , (2012).
- Pinault, D. A new stabilizing craniotomy-duratomy technique for single-cell anatomo-electrophysiological exploration of living intact brain networks. Journal of Neuroscience Methods. 141 (2), 231-242 (2005).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
- Picot, M. C., Baldy-Moulinier, M., Daures, J. P., Dujols, P., Crespel, A. The prevalence of epilepsy and pharmacoresistant epilepsy in adults: a population-based study in a Western European country. Epilepsia. 49 (7), 1230-1238 (2008).
- Pati, S., Alexopoulos, A. V. Pharmacoresistant epilepsy: from pathogenesis to current and emerging therapies. Cleve Clinical Journal of Medicine. 77 (7), 457-467 (2010).
