Elektrophoretische Lieferung von, in der Aminobutyrische Säure (GABA) in den Epileptischen Focus verhindert die Beschlagnahmungen in Mäusen
Summary
Die Herausforderung der Epilepsie-Forschung besteht darin, neuartige Therapien für Patienten zu entwickeln, bei denen die klassische Therapie unzureichend ist. Mit Hilfe eines neuen Protokolls — mit Hilfe eines implantierbaren Arzneimittelliefersystems — sind wir in der Lage, Anfälle bei anästhesierten Mäusen durch die elektrophoretische Lieferung von GABA in den epileptischen Fokus zu steuern.
Abstract
Epilepsie ist eine Gruppe von neurologischen Störungen, von denen Millionen von Menschen weltweit betroffen sind. Obwohl die Behandlung mit Medikamenten in 70% der Fälle hilfreich ist, beeinträchtigen schwere Nebenwirkungen die Lebensqualität der Patienten. Darüber hinaus ist ein hoher Anteil von epileptischen Patienten medikamentenresistent; In ihrem Fall sind Neurochirurgie oder Neurostimulation notwendig. Das Hauptziel der Epilepsieforschung ist es daher, neue Therapien zu finden, die entweder in der Lage sind, Epilepsie ohne Nebenwirkungen zu heilen oder wiederkehrende Anfälle bei medikamentenresistenten Patienten zu verhindern. Neuroengineering bietet neue Ansätze, indem es neue Strategien und Technologien einsetzt, um bessere Lösungen zu finden, um gefährdete epileptische Patienten zu heilen.
Als Demonstration eines neuartigen Versuchsprotokolls in einem akuten Mausmodell der Epilepsie wird ein direktes in situ elektrophoretisches Arzneimittelliefersystem verwendet. Eine neuronale Sonde, die eine mikrofluidische Ionenpumpe (μFIP) für die On-Demand-Medikamentenlieferung und die gleichzeitige Erfassung der lokalen neuronalen Aktivität enthält, wird implantiert und nachweislich in der Lage sein, die 4-Aminopyridine-induzierte (4AP-induzierte) Anfallsaktivität zu steuern. Event (SLE) Aktivität. Die Konzentration der Aminobutyrsäure (GABA) wird durch die genaue Kontrolle der GABA-Lieferung im physiologischen Bereich gehalten, um eine antiepileptische Wirkung im Anfallsfokus zu erzielen, aber keine überhemmten Rebound-Ausbrüche zu verursachen. Die Methode ermöglicht es sowohl die Erkennung von pathologischer Aktivität als auch von Interventionen, die Beschlagnahmung zu stoppen, indem sie hemmende Neurotransmitter direkt an den epileptischen Fokus mit präziser räumlicher Kontrolle liefert.
Durch die Entwicklung der experimentellen Methode können SLEs in einer sehr lokalisierten Weise induziert werden, die eine Anfallskontrolle durch die präzise abgestimmte GABA-Lieferung beim Anfall ermöglicht.
Introduction
Epilepsie ist die vierthäufigste neurologische Erkrankung: Etwa ein Prozent der Bevölkerung leidet an Epilepsie, und etwa ein Drittel der Betroffenen hat immer wiederkehrende Anfälle. In den meisten Fällen können Anfälle mit Medikamenten gesteuert werden. Allerdings muss die medikamentöse Behandlung für jeden Patienten individuell festgelegt werden, wo die richtige Dosierung Jahre dauernkann, bis 1,2gefunden werden. Darüber hinaus hat das meiste Medikament ernste Nebenwirkungen, die die Lebensqualität3,4, 5, 6,7reduzieren. Schließlich sind die Patienten in 30% der Fälle resistent gegen Medikamente, und im Falle eines konstanten Einfallserzeugerlokus kann nur eine widerspenstige Neurochirurgie das Auftreten von Anfällen8 dämpfen. Eine wichtige Initiative in der modernen Epilepsieforschung ist es daher, neue Strategien zu finden, die wiederkehrende Anfälle bei gefährdeten Patienten verhindern können, während gleichzeitig die Notwendigkeit starker Arzneimitteltherapien und invasiver Resistenzoperationen verringert wird.
Epileptische Anfälle treten auf, wenn es ein Ungleichgewicht innerhalb von Erregung und Hemmungskreisen gibt, entweder im gesamten Gehirn (generalisierte Epilepsie) oder in einem lokalisierten Teil des Gehirns (fokale Epilepsie), so dass Neuronen in einer abnormalen Weise entladen 9 , 10 , 11. Antiepileptische Medikamente können auf zwei verschiedene Arten bei der Anfallsprävention wirken: Entweder die Verringerung der Erregung oder die Verbesserung der Hemmung12. Konkret können sie entweder die elektrische Aktivität von neuronalen Zellen verändern, indem sie die Ionenkanäle in der Zellmembran 13 beeinflussen, oder sie können auf die chemische Übertragung zwischen Neuronen wirken, indem sie den hemmenden Neurotransmitter GABA oder den Erregungsrichter beeinflussen. Glutamat in den Synapsen14,15. Bei einigen Medikamenten ist die Wirkungsweise18unbekannt. Auch haben medikamentöse Behandlungen eine kontinuierliche Wirkung auf die Patienten und können sich nicht an die Prävalenzdynamik von Anfällen anpassen. Im Idealfall würden Medikamente mit spezifischen Wirkmechanismen auf die zugrunde liegenden epileptischen Prozesse wirken. Eine optimale Behandlung würde das Gehirn nicht interictally berühren, sondern sofort handeln, wenn sich ein Anfall entwickelt. Im Gegensatz dazu bedeutet die Medikation in allen Fällen von Epilepsie nun eine systematische Behandlung, die das gesamte Gehirn und den ganzen Körper des Patientenbetrifft.
Epileptische Anfälle können viele Jahre nach der anfänglichen Beleidigung wie Hirntrauma auftreten. Die Zeit zwischen der anfänglichen Beleidigung und dem Auftreten der ersten spontanen Anfälle ist durch erhebliche molekulare und zelluläre Reorganisationen gekennzeichnet, einschließlich neuronaler Todesfälle mit dem Verschwinden neuronaler Netzverbindungen und axonaler Die Neosynaptogenese mit dem Erscheinen neuer Verbindungen19,20,21. Sobald sich Anfälle wiederholen, neigen ihre Häufigkeit und Schwere dazu, dass sie mehr Hirnregionen mit sich bringen. Es ist wichtig, die Orte des Anfalls (epileptogene Regionen) von den Verbreitungsnetzen zu unterscheiden, da die Regeln der Anfallsgenese und-vermehrung unterschiedlich sein können. Untersuchungen an menschlichem Gewebe und experimentellen Modellen der Epilepsie haben wichtige Daten über die Reorganisation von Schaltkreisen und ihre Fähigkeit, Anfälle zu erzeugen20,21, 22, 23. Es ist jedoch schwierig festzustellen, ob diese Umstrukturierungen adaptive Reaktionen sind oder ob sie kausal mit der Epileptogenese oder der Anfallsgenese und-vermehrung 12 zusammenhängen.
Daher ist die Lokalisierung des epileptischen Schwerpunkts und die Anwendung von antiepileptischen Medikamenten vor Ort eine der größten Herausforderungen in der zeitgenössischen Epilepsie-Forschung. Mehrere Experimente mit Tiermodellen der Epilepsie und einige klinische Studien zielten darauf ab, den Beginn der Anfallsereignisse zu finden und die zugrunde liegendenMechanismen im Gehirn 24,25,26, 27 zudefinieren. Zu diesem Zweck haben wir ein neues Versuchsprotokoll mit dem von der 4P induzierten Epilepsie-Modell28,29, 30,31 ineiner akuten Mausvorbereitung entwickelt, das das präzise Einfügen von drei ermöglicht. Geräte in den vorgegebenen Bereich des Hippocampus, wo die Netzwerkaktivität in vivo in einer stark lokalisierten Weise manipuliert wird. Lokalisierte 4AP-Injektion durch eine Glasmikropipette hilft, epileptische SLEs an einem lokalisierten Ort im Hippocampus zu induzieren, während mit Hilfe der neuartigen, auf Polymer basierenden μFIP-Sonde die Kontrolle der Anfallsaktivität gleichzeitig durch die Aufnahme der neuronalen Elektrische Aktivität mit den Aufnahmesorten des Geräts. Die hippocampale Lokalfeldaktivität wird auch mit einer Multichannel-Siliziumsonde auf schichtspezifische Weise im Kortex und im Hippocampus gleichzeitig überwacht.
Die kürzlich erfundenen μFIP-Sonden arbeiten, indem sie ein angewandtes elektrisches Feld nutzen, um geladene Medikamente, die in einem mikrofluidischen Kanal gespeichert sind, über eine Ionenaustauschmembran (IEM) und in das umgebende Gewebe zu schieben (Abbildung 1). Das IEM transportiert selektiv nur eine Art von Ion (Kation oder Anion) und arbeitet so daran, sowohl die passive Diffusion im “Off”-Zustand als auch den Transport von gegensätzlich geladenen Arten aus dem umgebenden Gewebe in das Gerät zu begrenzen. Das elektrische Feld wird bei Bedarf durch die Anwendung einer kleinen Spannung (& lt;1 V) zwischen der Quellelektrode, die innen zum mikrofluidischen Kanal ist, und einer Zielelektrode, die außerhalb des Gerätes ist (in diesem Fall die Kopfschraube am Tiermodell) erzeugt. Die Rate der Arzneimittelzufuhr ist proportional zur angewandten Spannung und dem gemessenen Strom zwischen der Quell-und Zielelektroden. Die genaue Tuningbarkeit der Arzneimittelzustellung ist einer der Hauptvorteile der μFIP. Ein weiterer entscheidender Vorteil im Vergleich zu fluidischen oder druckbasierten Arzneimittelliefersystemen ist, dass es in der μFIP nur einen vernachlässigbaren Druckanstieg am Arzneimittellieferausgang gibt, da Medikamente ohne Trägerlösung über das IEM geliefert werden.
Es gibt eine kleine Menge passiver Epacht von GABA, wenn das μFIP “ausgeschaltet” ist, aber dies wurde gefunden, um SLEs nicht zu bewirken. Die μFIP sind maßgeschneidert nach herkömmlichen Mikrofabrikationsmethoden, die wir zuvorgemeldet haben 31.
Da eine Möglichkeit zur Verhinderung wiederkehrender Anfälle die Blockade von Netzentladungen zu Beginn oder sogar noch vor dem ersten Anfallsereignis ist, hat die vorgestellte Methode zur Lieferung des hemmenden Neurotransmitters GABA in den epileptischen Fokus großen großen Charakter. Heiltisches Potenzial zur Anfallskontrolle bei Patienten mit fokaler Epilepsie. Da GABA ein endogenes Substrat ist, lässt es intrinsische neuronale Eigenschaften in physiologischen Konzentrationen unverändert. Die lokale Anwendung der niedrigen GABA-Konzentrationen wird nur Zellen betreffen, die natürlich auf die Hemmung reagieren, und wird nur ähnliche Effekte wie die physiologische Hemmung verursachen, im Gegensatz zu einer tiefen Hirnstimulation (DBS), die unspezifische Aktionen hat, indem sie alle Zellen stimuliert. Das neuronale Netz in seiner Umgebung, was eine gemischte Reaktion mit Anregung und Hemmung. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorgeschlagene Methode einen spezifischeren Ansatz zur Beschlagnahmungskontrolle bietet als DBS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durch die Entwicklung eines neuen Versuchsprotokolls in einem akuten Mausmodell der Epilepsie konnten SLEs mit Hilfe eines in den epileptischen Fokus implantierten μFIP erfolgreich gesteuert werden. Dank seiner Fähigkeit, GABA zeitnah und räumlich präzise zu liefern, wurden 4P-induzierte SLEs zu Beginn der Beschlagnahmungen gesteuert. Die Behandlung von Epilepsie ist theoretisch möglich, wenn die Kontrolle der neuronalen Netzentladungen am Ort des Anfallstarts erreicht wird. Das vorgestellte Protokoll erwies sich al…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.M.P. erkennt die Finanzierung durch ein Whitaker International Scholar Stipendium an, das vom Institut für Internationale Bildung verwaltet wird. A.K. wurde von der Marie Curie IEF (Nr. 625372) gesponsert. A.W. erkennt die Finanzierung des Europäischen Forschungsrates (ERC) im Rahmen des Forschungs-und Innovationsprogramms “Horizont 2020” der Europäischen Union an (Zuschussvertrag Nr. 716867). A.W. würdigt zudem die Exzellenzinitiative der Universität Aix-Marseille-A * MIDEX, ein französisches “Investissements d ‘ Avenir”-Programm. Die Autoren danken Dr. Ilke Uguz, Dr. Sahika Inal, Dr. Vincenzo Curto, Dr. Mary Donahue, Dr. Marc Ferro und Zsófia Maglóczky für ihre Teilnahme an fruchtbaren Diskussionen.
Materials
| 4AP | Sigma | 275875 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab15007 | |
| Amplifier | Neuralynx, Montana, USA | Digital Lynx 4SX | |
| Amplifier | Ampliplex | KJE-1001 | |
| Atlas Stereotaxique | Allen Atlas | 978-0470054086 | |
| Borosilica glass pipette | Sutter | BF120-69-15 | |
| Brain Matrix | WPI | RBMA-200C | |
| Bone trimmer | FST | 16109-14 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Connector | INSTECH | SC20/15 | |
| Coton tige | Monoprix | EMD 6107OD | |
| Cover slip | Menzel-Glass | 15747592 | |
| DiI Stain | Thermo Fisher | D282 | |
| DMSO | Sigma | 11412-11 | |
| Drill | FOREDOM | K1070 | |
| Forceps | F.S.T. | 11412-11 | |
| GABA | Sigma | A2129 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | Thermofisher | 53-9892-80 | |
| GOPS | Sigma | 440167-100M | |
| Hamilton seringe | Hamilton | 80330 | |
| Headscrew | Component Supply | TX00-2FH | |
| Heating pad | Harvard apparatus | 341446 | |
| Injection Pump | WPI | UMP3-3 | |
| Keithley | Tektoronix | 216A | |
| Ketamine | Renaudin | 5787419 | |
| Magnetic holder | Narishige | GJ-1 | |
| Mice | Charles River | 612 | |
| Motoric manipulator | Scientifica, UK | IVM | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 7558807 | |
| NeuroTrace DiI | Thermofisher | N22880 | |
| Paper towel | KIMBERLY CLARK | 7552000 | |
| PB | Sigma | P4417 | |
| PEDOT:PSS | CLEVIOS | 81076212 | |
| PFA | Acros Organic | 30525-89-4 | |
| Rectal temperature probe | Harvard apparatus | 521591 | |
| Ropivacaine | KABI | 1260216 | |
| Saline | Sigma | 7982 | |
| Scalpel | F.S.T | AUST R195806 | |
| Seringue | BD Medical | 324826 | |
| Serrefine clamp | F.S.T | 18050-28 | 4 is recommended |
| Silicon probe | NeuroNexus, Michigan, USA | A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703 | |
| Stereotoxic frame | Stoelting | 51733U | |
| Superfrost Slide | ThermoScientific | J38000AMNZ | |
| Tubing | INSTECH | LS20 | |
| Vaseline | Laboratoire Gilbert | 3518646126611 | |
| Vectashield DAPI | Vector Laboratories, California, USA | H-1200-10 | |
| Vibratome, Leica VT1200S | Leica Microsystems | 1491200S001 | |
| Xylazine | Bayer | 4007221032311 |
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