간 질 초점으로 γ-아미노 버터 산 (GABA)의 전기 영동 전달은 생쥐의 발작을 방지 합니다.

Summary

간 질 연구의 도전은 고전적인 치료가 부적당 한 환자를 위한 새로운 치료를 개발 하는 것입니다. 새로운 프로토콜을 사용 하 여-이식 가능한 약물 전달 시스템의 도움으로-우리는 간 질 초점에 GABA의 전기 영동 전달에 의해 마 취 된 쥐에서 발작을 제어할 수 있습니다.

Abstract

간 질은 전세계 수백만의 사람들에 영향을 미치는 신경학 상 무질서의 그룹입니다. 약물 치료는 70%의 경우에 도움이 되지만, 심각한 부작용은 환자의 삶의 질에 영향을 미친다. 더욱이, 간 질 환자의 높은 비율은 약물 내성; 그들의 경우에는 신경 수술이 나 신경 자극이 필요 합니다. 따라서 간 질 연구의 주요 목표는 부작용 없이 간 질을 치료 하거나 약물 내성 환자에서 재발 성 발작을 예방 할 수 있는 새로운 치료법을 발견 하는 것입니다. 신경 공학은 새로운 전략과 기술을 사용 하 여 간 질 환자를 위험에 치료할 수 있는 더 나은 솔루션을 찾도록 합니다.

간 질병의 급성 마우스 모델에서 신규 한 실험 프로토콜을 시연 하는 것으로 서, 직접적으로 현장 전기 영동 약물 전달 시스템이 사용 된다. 즉, 미세 유체 이온 펌프 (µ FIP)를 포함 하는 신경 프로브가 온 디맨드 약물 전달 및 국 소 신경 활성의 동시 기록을 위해 이식 되 고 4-aminopyridine 유도 (4AP 유도) 발작과 같은 제어가 가능한 것으로 입증 이벤트 (SLE) 활동. Γ-아미노 부 티 르 산 (GABA) 농도는 발작 집중에의 한 항 간 질 효과에 도달 하는 GABA 전달의 정밀한 제어에 의해 생리 적 범위 내에서 유지 되지만 과잉 억제 유도 된 반발 파열을 야기 하지 않는다. 이 방법을 통해 병리학 적 활동과 개입을 감지 하 여 억제 신경 전달 물질을 정확한 시 공간적 제어와 함께 간 질 초점에 직접 전달 함으로써 발작을 막을 수 있습니다.

실험 방법에 대 한 개발의 결과로 서, SLEs는 발작 발병 시에 정확 하 게 조정 된 GABA 전달을 통해 발작 제어를 허용 하는 고도로 국 소화 된 방식으로 유도 될 수 있다.

Introduction

간 질은 넷째 가장 일반적인 신경 장애: 인구의 약 1%는 간 질을 앓고 있으며, 영향을 받는의 1/3 정도 재발 발작이 있습니다. 대부분의 경우 발작을 약물로 조절할 수 있습니다. 그러나, 약물 치료는 개별적으로 모든 환자에 대 한 설정 될 필요가, 어디 적절 한 먹이 지 수 년은^1,2를 찾는 데 걸리는. 추가적으로, 대부분의 약물은 삶의 질을 감소 시키는 심각한 부작용을 갖는다^,4,⁵,^6,7. 마지막으로, 환자의 30%에서 환자는 약물에 내성이 있으며, 일정 한 단일 발작 발생기 궤적의 경우에만 전염 성 신경 수술이 발작의 발생을 감쇠 할 수 있습니다⁸. 따라서, 현대 간 질 연구에 있는 주요한 이니셔티브는 위험한 상태에 환자에 있는 재발 하는 발작을 방지할 수 있는 새로운 전략을 발견 하는 것입니다, 강한 약물 치료 및 침략 적인 전염 하는 수술의 필수품을 감소 시키면서.

간 질 발작이 뇌의 흥분 성 및 억제 회로 내에서 불균형이 있을 때 발생 (일반화 된 뇌 전 증) 또는 두뇌의 국부 적 인 부분 (초점 간 질), 비정상적인 패션에서 뉴런 방전 등^{9 , 10 , 11}. 항 경련 제는 발작 예방에서 두 가지 방법으로 작용할 수 있습니다: 여기를 감소 시키거나 억제를 강화¹². 구체적으로, 그들은 세포 막 (¹³ )에서 이온 채널에 영향을 주는 것에 의해 뉴런 세포의 전기적 활성을 수정 하거나 억제 신경 전달 물질 GABA 또는 흥분 성의 영향을 미치는 신경 간의 화학적 전달에 작용 하 여 시 냅 스^14,15에서 조미료. 일부 약물에 대 한, 행동의 모드는 알 수 없는¹⁸. 또한, 약물 치료는 환자에 게 지속적인 영향을 주며 발작의 유 병 역학에 적응할 수 없습니다. 이상적으로, 행동의 특정 메커니즘을 가진 약물은 근본적인 간 질 과정에 행동. 최적의 치료는 뇌의 interictally를 만지지 않을 것 이지만 발작이 발달 하기 시작할 때 즉시 작용할 것입니다. 그와는 대조적으로, 간 질의 모든 경우에, 약물은 지금 전체 뇌와 환자의 몸 전체에 영향을 미치는 체계적인 치료를 의미⁹.

간 질 발작 뇌 외상 등 초기 모욕 후 몇 년 동안 나타날 수 있습니다. 첫 번째 자발적 발작의 초기 모욕과 발생 사이의 기간은 신경 네트워크 연결 및 축 삭의 실종과 함께 신경 사 멸을 포함 하 여 상당한 분자 및 세포 조직 재구성을 특징으로 한다 새로운 연결의 출현으로 발 아/neosynaptogenesis¹⁹,²¹. 발작이 재발 되 면, 그들의 빈도와 심각도는 증가 하는 경향이 있다, 더 많은 뇌 영역을 포함. 발작 기원과 전파의 규칙이 다를 수 있기 때문에, 전파 네트워크에서 발작 개시 (epileptogenic 지역)의 사이트를 구별 하는 것이 중요 합니다. 인간 조직 및 간 질 실험 모델에서 수행 된 연구는 회로의 재 조직 및 발작 생성 능력에 관한 중요 한 데이터를 제공 하 고 있다²⁰,²¹,^{22, 23}. 그러나 이러한 재조직이 적응 적 응답 인지 또는 epileptogenesis 발작 발생 및 전파¹²와 관련이 있는지를 확인 하는 것은 어렵습니다.

따라서, 간 질 초점을 현지화 하 고 항 경련 제를 국 소 적으로 적용 하는 것은 현대 간에 서 연구에서 주요 과제 중 하나입니다. 간 질 및 일부 임상 연구의 동물 모델을 사용 하는 몇 가지 실험은 발작 사건의 발병을 발견 하 고 뇌^24,25,26,²⁷에서 기저 기전을 정의 하는 것을 목적으로 한다. 이를 위해, 4ap-유도 간 질 모델 (²⁸,^29,30,31 )을 사용 하는 새로운 실험 프로토콜을 개발 하 여 3 개의 정밀한 삽입을 가능 하 게 하는 급성 마우스 준비 생체 내 네트워크 활동이 고도로 현지화 된 방식으로 조작 되는 해 마의 주어진 영역으로 장치. 유리 마이크로 피 펫에의 한 국부 적 4AP 주입은 해 마에서 국 소화 된 자리에서 간 질 SLEs를 유도 하는 데 도움을 주며, 한편 신규 한 중합체 기반 µ FIP 프로브의 도움으로 발작 활성의 제어가 동시에 뉴런을 기록 함으로써 달성 된다 장치의 녹화 사이트와 전기적 활동. 해 마 지역 필드 활동은 또한 피 질 및 해 수에서 동시에 층 별 방식으로 멀티 채널 실리콘 프로브로 모니터링 된다.

최근에 발명 한 µ FIP 프로브는 적용 된 전기장을 사용 하 여 마이크로 유체 채널에 저장 된 전 하 약물을 이온 교환 막 (IEM)을 통해 주변 조직으로 밀어내는 방식으로 작동 합니다 (그림 1). IEM은 한 종류의 이온 (양이온 또는 음이온)만을 선택적으로 전송 하 고, 따라서 “off” 상태에서 수동 확산을 제한 하 고 주변 조직에서 장치에 반대 하 여 충전 된 종을 수송 하는 작업을 합니다. 전기장은 미세 유체 채널 내부에 있는 소스 전극과 디바이스 외부에 있는 타겟 전극 사이에 작은 전압 (< 1V)을 인가 함으로써 필요에 따라 생성 된다 (이 경우에는 동물 모델의 헤드 스크류). 약물 전달 속도는 소스와 타겟 전극 사이에 인가 된 전압과 측정 된 전류에 비례 합니다. 약물 전달의 정확한 tunability는 µ FIP의 주요 이점 중 하나입니다. 또 다른 중요 한 이점은, 유체 또는 압력 기반 약물 전달 시스템에 비해, µ FIP에서 약물이 그들의 캐리어 용액 없이 IEM을 통해 전달 되는 약물 전달 출구에서 무시할 압력 증가가 있다는 것 이다.

Μ FIP는 “off” 때 GABA의 수동 누출의 소량이 있다, 하지만 이것은 SLEs를 영향을 하지 발견. Μ FIP는 우리가 이전에 보고 한 전통적인 미세 제조 방법에 따라 주문 제작³¹.

재발 성 발작을 방지 하는 한 가지 방법은 처음에 또는 심지어 첫 번째 발작 이벤트 전에 네트워크 방전의 봉쇄 이기 때문에, GABA 억제 신경 전달 물질을 간 질 초점으로 전달 하기 위한 제시 된 방법은 훌륭한 국 소 간 질 환자에서 발작 제어를 위한 치료 적 가능성. 이후 GABA는 내 인 성 기질, 그것은 생리 적 농도에서 변경 되지 본질적인 신경 속성을 나뭇잎. GABA의 낮은 수준의 로컬 응용 프로그램은 자연스럽 게 억제에 응답 하는 세포에 영향을 미칠 것입니다., 생리 적 억제에 비슷한 효과 일으킬 것입니다., 깊은 뇌 자극에 반대 (DBS), 모든 세포를 자극 하 여 비 특이 한 행동 그 환경에서 신경 네트워크의, 여기 및 억제를 포함 하는 혼합 된 응답을 일으키는. 결론적으로, 제안 된 방법은 DBS 보다 발작 제어에 대 한 보다 구체적인 접근법을 제공 한다.

Protocol

모든 실험 절차는 연구소 드 신경 과학 des 시스템의 윤리적 지침에 따라 수행 하 고 지역 윤리 위원회 및 수의학 사무실에 의해 승인. 참고: 17 명의 성인 남성 OF1 마우스를 실험에 사용 하였다. 마우스는 음식 및 물 사용 가능한 광고 libitum와 12 h 빛/어두운 주기에 훈련을 받았다. 1. 마 취 케 타 민과 자일 린 100 (복 강 내의 체중과 …

Representative Results

여기에 제시 된 절차를 사용 하 여 마 취 된 마우스에서 4AP 간 질 모델을 이용 하 여 발작을 조절 하는 것에 대 한 항 경련 제 집중을 달성할 수 있다. 임 플 란 트의 정확한 국 소화 (그림 2)는 해 마 국부 잠재력 (Lfps, 도 4)을 기록 하 여 작은 해 마 발작을 유도 하 고 발작 발병 시 GABA를 전달 하는 데 도움이 되었습니다. 임 플 란 ?…

Discussion

간 질에 대 한 급성 마우스 모델에서 새로운 실험적 프로토콜을 개발 함으로써, SLEs는 발작 초점에 이식 된 µ FIP의 도움으로 성공적으로 제어 될 수 있었습니다. 시간 및 공간 정밀도와 GABA를 제공 하는 그것의 기능 덕분에, 4AP 유도 SLEs 포착의 개시에 통제 되었다. 간 질병의 치료는 이론적으로는 발작 시작의 장소에서 신경 네트워크 방전의 제어가 달성 되는 경우에 가능 하다. 제시 된 프로토콜은…

Materials

4AP	Sigma	275875
Alexa Fluor 488	Abcam	ab15007
Amplifier	Neuralynx, Montana, USA	Digital Lynx 4SX
Amplifier	Ampliplex	KJE-1001
Atlas Stereotaxique	Allen Atlas	978-0470054086
Borosilica glass pipette	Sutter	BF120-69-15
Brain Matrix	WPI	RBMA-200C
Bone trimmer	FST	16109-14
Confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Connector	INSTECH	SC20/15
Coton tige	Monoprix	EMD 6107OD
Cover slip	Menzel-Glass	15747592
DiI Stain	Thermo Fisher	D282
DMSO	Sigma	11412-11
Drill	FOREDOM	K1070
Forceps	F.S.T.	11412-11
GABA	Sigma	A2129
GFAP Monoclonal Antibody	Thermofisher	53-9892-80
GOPS	Sigma	440167-100M
Hamilton seringe	Hamilton	80330
Headscrew	Component Supply	TX00-2FH
Heating pad	Harvard apparatus	341446
Injection Pump	WPI	UMP3-3
Keithley	Tektoronix	216A
Ketamine	Renaudin	5787419
Magnetic holder	Narishige	GJ-1
Mice	Charles River	612
Motoric manipulator	Scientifica, UK	IVM
Na2HPO4	Sigma	255793
NaH2PO4	Sigma	7558807
NeuroTrace DiI	Thermofisher	N22880
Paper towel	KIMBERLY CLARK	7552000
PB	Sigma	P4417
PEDOT:PSS	CLEVIOS	81076212
PFA	Acros Organic	30525-89-4
Rectal temperature probe	Harvard apparatus	521591
Ropivacaine	KABI	1260216
Saline	Sigma	7982
Scalpel	F.S.T	AUST R195806
Seringue	BD Medical	324826
Serrefine clamp	F.S.T	18050-28	4 is recommended
Silicon probe	NeuroNexus, Michigan, USA	A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703
Stereotoxic frame	Stoelting	51733U
Superfrost Slide	ThermoScientific	J38000AMNZ
Tubing	INSTECH	LS20
Vaseline	Laboratoire Gilbert	3518646126611
Vectashield DAPI	Vector Laboratories, California, USA	H-1200-10
Vibratome, Leica VT1200S	Leica Microsystems	1491200S001
Xylazine	Bayer	4007221032311