将γ-氨基丁酸 (GABA) 电泳到癫痫焦点中进行, 防止小鼠癫痫发作
Summary
癫痫研究的挑战是在经典治疗不足的情况下, 为患者开发新的治疗方法。使用一个新的协议–在植入药物输送系统的帮助下–我们能够通过将 GABA 的电泳传递到癫痫的焦点来控制麻醉小鼠的癫痫发作。
Abstract
癫痫是一组影响全球数百万人的神经疾病。虽然在70% 的病例中, 药物治疗是有帮助的, 但严重的副作用会影响患者的生活质量。此外, 很高比例的癫痫患者是耐药;在他们的情况下, 神经外科或神经刺激是必要的。因此, 癫痫研究的主要目标是发现新的疗法, 这些疗法要么能够治疗没有副作用的癫痫, 要么能预防耐药患者的反复发作。神经工程提供了新的方法, 通过使用新的策略和技术, 找到更好的解决方案, 以治愈癫痫患者的风险。
为了演示一种新的癫痫急性小鼠模型实验方案, 采用了直接原位电泳给药系统。即植入一种包含微流体离子泵 (μFIP) 的神经探针, 用于按需药物输送和局部神经活动的同步记录, 并证明该探头能够控制 4-氨基吡啶诱导 (4ap 诱导的) 癫痫发作样事件 (SLE) 活动。通过精确控制 GABA 分娩, 在癫痫发作焦点中达到抗癫痫作用, 但不会引起过量抑制引起的反弹爆发, 从而将γ-氨基丁酸 (GABA) 浓度保持在生理范围内。该方法允许病理活动的检测和干预, 以阻止癫痫发作直接提供抑制神经递质的癫痫病灶与精确的时空控制。
由于实验方法的发展, 可在高度局部的方式诱导 Sle, 允许通过在癫痫发作开始时精确调整 GABA 的传递来控制癫痫发作。
Introduction
癫痫是第四大最常见的神经疾病: 约1% 的人口患有癫痫, 约三分之一的受影响人群有反复发作。在大多数情况下, 癫痫发作可以通过药物控制。然而, 药物治疗需要为每个患者单独设置, 在那里适当的剂量可能需要数年时间才能找到1,2。此外, 大多数药物有严重的副作用, 降低生活质量3,4,5,6,7。最后, 在30% 的病例中, 患者对药物有抗药性, 在单一癫痫发电机位点不变的情况下, 只有切除神经外科才能减轻癫痫发作的发生 8.因此, 现代癫痫研究的一项重大举措是发现新的策略, 可以防止高危患者的反复发作, 同时减少强效药物治疗和侵入性手术的必要性。
癫痫发作发生时, 有一个不平衡的兴奋和抑制电路, 无论是在整个大脑 (全身性癫痫) 或在大脑的局部部分 (焦点癫痫), 使神经元放电在一个不正常的方式9,10,11. 抗癫痫药物在预防癫痫发作方面可以有两种不同的作用: 减少兴奋或增强抑制12。具体来说, 它们可以通过影响细胞膜13中的离子通道来改变神经元细胞的电活动,也可以通过影响抑制神经递质 gaba 或兴奋性来作用于神经元之间的化学传递。谷氨酸在突触 14,15。对于一些药物, 作用方式是未知的 18。另外, 药物治疗对患者有持续的影响, 无法适应癫痫发作的流行动态。理想情况下, 具有特定作用机制的药物会对潜在的癫痫过程起作用。最佳治疗方法不会接触大脑的有趣, 但在癫痫发作开始发展时, 会立即采取行动。与此形成鲜明对比的是, 在所有癫痫病例中, 药物治疗现在都意味着系统的治疗, 影响到整个大脑和患者的整个身体。
癫痫发作可能出现在最初的侮辱后很多年, 如脑外伤。最初的侮辱和第一次自发发作之间的时期的特点是相当大的分子和细胞重组, 包括神经元死亡与神经元网络连接的消失和轴突随着新连接的出现 19,20,21。一旦癫痫发作成为复发, 其频率和严重程度往往会增加, 涉及更多的大脑区域。区分癫痫发作部位 (癫痫发生区) 和传播网络是很重要的, 因为癫痫发作的起源和繁殖的规则可能不同。对癫痫的人体组织和实验模型进行的研究提供了关于电路重组及其产生癫痫发作 的能力的重要数据。23. 然而, 很难确定这些重组是适应性反应, 还是与癫痫发生或癫痫发生和繁殖有因果关系 12.
因此, 将癫痫焦点定位, 在局部应用抗癫痫药物, 是当代癫痫研究的主要挑战之一。一些使用癫痫动物模型的实验和一些临床研究旨在发现癫痫发作事件的开始, 并确定大脑中的潜在机制 24, 25,26,27.为此, 我们开发了一个新的实验方案, 使用4ap 诱导的急性小鼠制剂中的模型 28、29、30、31 , 可以精确插入三个设备进入海马体的给定区域 , 在那里 , 体内的网络活动以高度局部化的方式纵。玻璃微移液器局部注射4AP 有助于在海马区的局部点诱导癫痫性 Sle, 而借助新型的基于聚合物的μFIP 探针, 通过记录神经元, 同时实现对癫痫发作活动的控制设备的记录站点的电气活动。海马局部场活动也被监测与多通道硅探针在皮层和海马同时分层特定的方式。
最近发明的μFIP 探针通过使用外加电场将储存在微流体通道中的带电药物通过离子交换膜 (IEM) 并向周围组织推送 (图 1)。IEM 只选择性地传输一种离子 (阳离子或阴离子), 因此, 努力限制处于 “关闭” 状态的被动扩散和从周围组织向设备中传输相反电荷的物种。电场是根据需要在微流体通道内部的源电极和设备外部的目标电极 (在这种情况下, 是动物模型上的头螺钉) 之间施加小电压 (& lt;1 V) 而产生的。药物输送速率与施加的电压和源电极与目标电极之间的测量电流成正比。药物输送的精确可调谐性是μFIP 的主要优点之一。与基于流体或压力的药物输送系统相比, 另一个关键优势是, 在μFIP 中, 药物输送出口的压力增加可以忽略不计, 因为药物是在没有载体解决方案的情况下通过 IEM 输送的。
当μFIP “关闭” 时, GABA 有少量的被动泄漏, 但这被发现不会影响 Slet。ΜFIP 是按照我们先前报告的传统微细加工方法定制的。
由于预防反复发作的一种方法是在第一次癫痫发作一开始甚至之前封锁网络放电, 因此将抑制神经递质 GABA 传递到癫痫焦点的方法有很大的意义重点性癫痫患者癫痫发作控制的治疗潜力。由于 GABA 是内源性底物, 它在生理浓度中保持固有神经元特性不变。在当地应用低水平的 GABA 只会影响细胞对抑制的自然反应, 只会对生理抑制产生类似的影响, 与深部大脑刺激 (DBS) 相反, 深部大脑刺激通过刺激所有细胞而具有不具体的作用在其环境中的神经元网络, 造成混合反应, 涉及兴奋和抑制。总之, 该方法为扣押控制提供了比星展银行更具体的方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
通过在急性癫痫小鼠模型中开发新的实验方案, 可以借助植入癫痫病灶的μFIP 成功地控制 Slei。由于其能够在时间和空间上精确地提供 GABA, 在癫痫发作开始时控制了4ap 诱导的 Slis。如果在癫痫发作开始的地方实现了神经网络放电的控制, 那么癫痫的治疗在理论上是可能的。所提出的协议证明了这一点, 如果注射抑制神经递质 GABA 的定位足够精确, 及时达到癫痫的焦点。然而, 在癫痫发作影响大脑较大…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C. m. p. 感谢国际教育研究所管理的 Whitaker 国际学者赠款。A. k. 是由玛丽居里 IEF (625372 号) 赞助的。A. w. 确认欧洲研究理事会 (ERC) 根据欧洲联盟的 “地平线 2020” 研究和创新方案 (716867 号赠款协议) 提供的资金。A. w. 还承认艾克斯-马赛大学的卓越倡议—-a * MIDEX, 法语 “阿韦尼尔邀请” 方案。提交人感谢 Ilke Uguz 博士、Sahika Inal 博士、Vincenzo Curto 博士、Mary Donahue 博士、Marc Ferroo 博士和 Zsófia Maglóczky 参加了富有成果的讨论。
Materials
| 4AP | Sigma | 275875 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab15007 | |
| Amplifier | Neuralynx, Montana, USA | Digital Lynx 4SX | |
| Amplifier | Ampliplex | KJE-1001 | |
| Atlas Stereotaxique | Allen Atlas | 978-0470054086 | |
| Borosilica glass pipette | Sutter | BF120-69-15 | |
| Brain Matrix | WPI | RBMA-200C | |
| Bone trimmer | FST | 16109-14 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Connector | INSTECH | SC20/15 | |
| Coton tige | Monoprix | EMD 6107OD | |
| Cover slip | Menzel-Glass | 15747592 | |
| DiI Stain | Thermo Fisher | D282 | |
| DMSO | Sigma | 11412-11 | |
| Drill | FOREDOM | K1070 | |
| Forceps | F.S.T. | 11412-11 | |
| GABA | Sigma | A2129 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | Thermofisher | 53-9892-80 | |
| GOPS | Sigma | 440167-100M | |
| Hamilton seringe | Hamilton | 80330 | |
| Headscrew | Component Supply | TX00-2FH | |
| Heating pad | Harvard apparatus | 341446 | |
| Injection Pump | WPI | UMP3-3 | |
| Keithley | Tektoronix | 216A | |
| Ketamine | Renaudin | 5787419 | |
| Magnetic holder | Narishige | GJ-1 | |
| Mice | Charles River | 612 | |
| Motoric manipulator | Scientifica, UK | IVM | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 7558807 | |
| NeuroTrace DiI | Thermofisher | N22880 | |
| Paper towel | KIMBERLY CLARK | 7552000 | |
| PB | Sigma | P4417 | |
| PEDOT:PSS | CLEVIOS | 81076212 | |
| PFA | Acros Organic | 30525-89-4 | |
| Rectal temperature probe | Harvard apparatus | 521591 | |
| Ropivacaine | KABI | 1260216 | |
| Saline | Sigma | 7982 | |
| Scalpel | F.S.T | AUST R195806 | |
| Seringue | BD Medical | 324826 | |
| Serrefine clamp | F.S.T | 18050-28 | 4 is recommended |
| Silicon probe | NeuroNexus, Michigan, USA | A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703 | |
| Stereotoxic frame | Stoelting | 51733U | |
| Superfrost Slide | ThermoScientific | J38000AMNZ | |
| Tubing | INSTECH | LS20 | |
| Vaseline | Laboratoire Gilbert | 3518646126611 | |
| Vectashield DAPI | Vector Laboratories, California, USA | H-1200-10 | |
| Vibratome, Leica VT1200S | Leica Microsystems | 1491200S001 | |
| Xylazine | Bayer | 4007221032311 |
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