A entrega electrophoretic do ácido γ-aminobutyric (GABA) no foco epileptic impede apreensões nos ratos

Summary

O desafio da pesquisa da epilepsia é desenvolver tratamentos novos para os pacientes onde a terapia clássica é inadequada. Usando um protocolo novo — com a ajuda de um sistema implantáveis da entrega da droga — nós podemos controlar apreensões em ratos anestesiados pela entrega electrophoretic de GABA no foco epileptic.

Abstract

A epilepsia é um grupo de distúrbios neurológicos que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. Embora o tratamento com medicação seja útil em 70% dos casos, efeitos colaterais graves afetam a qualidade de vida dos pacientes. Além disso, uma porcentagem elevada de pacientes epileptic é droga-resistente; em seu caso, a neurocirurgia ou a neuroestimulação são necessárias. Conseqüentemente, o objetivo principal da pesquisa da epilepsia é descobrir as terapias novas que são ou capazes de curar a epilepsia sem efeitos secundários ou de impedir apreensões periódicas em pacientes droga-resistentes. A Neuroengenharia fornece novas abordagens usando estratégias e tecnologias inovadoras para encontrar melhores soluções para curar pacientes epilépticos em risco.

Como uma demonstração de um protocolo experimental novo em um modelo agudo do rato da epilepsia, um sistema electrophoretic direto in situ da entrega da droga é usado. A saber, uma sonda neural incorporando uma bomba de íon microfluídico (μFIP) para a entrega de medicamentos demanda e gravação simultânea de atividade neural local é implantada e demonstrou ser capaz de controlar a convulsão induzida por 4-aminopyridina (induzida por 4AP) como atividade de evento (SLE). A concentração do ácido γ-aminobutírico (GABA) é mantida na escala physiological pelo controle preciso da entrega de GABA para alcangar um efeito antiepiléptico no foco da apreensão mas para não causar explosões overinibição-induzidas da repercussão. O método permite a deteção da atividade patológica e da intervenção parar apreensões entregando neurotransmissores inibitórios diretamente ao foco epileptic com controle armazenamento preciso.

Em conseqüência dos desenvolvimentos ao método experimental, os SLEs podem ser induzidos em uma maneira altamente localizada que permita o controle da apreensão pela entrega precisamente ajustada de GABA no início da apreensão.

Introduction

A epilepsia é a quarta desordem neurológica mais comum: cerca de 1% da população sofre de epilepsia, e cerca de um terço dos afetados têm convulsões recorrentes. Na maioria dos casos, as convulsões podem ser controladas com medicação. No entanto, o tratamento medicamentoso precisa ser ajustado para cada paciente individualmente, onde a dosagem adequada pode levar anos para encontrar^1,2. Adicionalmente, a maior parte da medicação tem efeitos colaterais graves que reduzem a qualidade de vida^3,4,5,6,7. Finalmente, em 30% dos casos os pacientes são resistentes à medicação, e no caso de um locus gerador de convulsão único constante, apenas a neurocirurgia resectiva pode atenuar a ocorrência de convulsões⁸. Conseqüentemente, uma iniciativa principal na pesquisa moderna da epilepsia é descobrir as estratégias novas que podem impedir apreensões periódicas nos pacientes em risco, ao reduzir a necessidade de terapias fortes da droga e de cirurgias resective invasoras.

As apreensões epilépticas ocorrem quando há um desequilíbrio dentro dos circuitos excitatórios e inibitórios durante todo o cérebro (epilepsia generalizada) ou em uma parte localizada do cérebro (epilepsia focal), tais que os neurônios corriam em uma forma anormal^{9 , 10} de ^{, 11}. as Drogas antiepilépticas podem atuar de duas maneiras diferentes na prevenção da apreensão: diminuindo a excitação ou aumentando a inibição¹². Especificamente, eles podem modificar a atividade elétrica das células neuronais, afetando os canais iônicos na membrana celular¹³ ou agir sobre a transmissão química entre os neurônios, afetando o NEUROTRANSMISSOR inibidor GABA ou o excitatório glutamato nas sinapses^14,15. Para alguns medicamentos, o modo de ação é desconhecido¹⁸. Além disso, os tratamentos medicamentoso têm um efeito contínuo sobre os pacientes e não podem se adaptar à dinâmica de prevalência de crises convulsivas. Idealmente, drogas com mecanismos específicos de ação atuariam nos processos epilépticos subjacentes. Um tratamento óptimo não tocaria o interictalmente do cérebro mas actuaria imediatamente quando uma apreensão começa se tornar. Em contraste com isso, em todos os casos de epilepsia, a medicação agora significa um tratamento sistemático, afetando todo o cérebro e todo o corpo do paciente⁹.

As apreensões epilépticas podem aparecer muitos anos após o insulto inicial tal como o traumatismo de cérebro. O período entre o insulto inicial e a ocorrência das primeiras apreensões espontâneas é caracterizado por reorganizações moleculars e celulares consideráveis, incluindo a morte neuronal com o desaparecimento de conexões de rede neuronal e axonal sprouting/neosynaptogenesis com a aparência de conexões novas^19,20,21. Uma vez que as apreensões se tornam recorrentes, sua frequência e gravidade tendem a aumentar, envolvendo mais regiões cerebrais. É importante distinguir os locais do início da apreensão (regiões epileptogenic) das redes da propagação, porque as réguas da gênese e da propagação da apreensão podem diferir. Pesquisas realizadas em tecidos humanos e modelos experimentais de epilepsia forneceram dados importantes sobre a reorganização dos circuitos e sua capacidade de gerar convulsões^{20,21,22, 23}. no entanto, é difícil determinar se essas reorganizações são respostas adaptativas ou se elas são causalmente relacionadas à epileptogênese ou à gênese da convulsão e à propagação¹².

Portanto, localizando o foco epiléptico e aplicando drogas antiepilépticas localmente são um dos principais desafios na pesquisa contemporânea de epilepsia. Vários experimentos utilizando modelos animais de epilepsia e alguns estudos clínicos objetivam encontrar o início dos eventos convulsivos e definir os mecanismos subjacentes no cérebro^24,25,26,27. Para tanto, desenvolvemos um novo protocolo experimental utilizando o modelo de epilepsia induzido pelo 4ap²⁸,^29,30,31 em uma preparação aguda de camundongo, o que permite a inserção precisa de três dispositivos na área dada do hipocampo, onde a atividade de rede in vivo é manipulada de forma altamente localizada. A injeção 4AP localizada por uma micropipeta de vidro ajuda a induzir SLEs epileptic em um ponto localizado no hipocampo, quando com a ajuda da ponta de prova polímero-baseada nova do μFIP o controle da atividade da apreensão é conseguido simultaneamente gravando o neuronal atividade elétrica com os locais de gravação do dispositivo. A atividade de campo local de hippocampal é monitorada igualmente com uma ponta de prova multicanal do silicone em uma maneira camada-específica no córtice e no hipocampo simultaneamente.

As pontas de prova recentemente inventadas do μfip trabalham usando um campo elétrico aplicado para empurrar as drogas carregadas armazenadas em um canal microfluídicos através de uma membrana da troca iónica (IEM) e para fora ao tecido circunvizinho (Figura 1). O IEM transporta seletivamente somente um tipo de íon (cátion ou Anion) e, assim, trabalha para limitar a difusão passiva no estado “off” e o transporte de espécies oposta carregadas do tecido circunvizinho no dispositivo. O campo elétrico é criado demanda aplicando uma pequena voltagem (< 1 V) entre o eletrodo de origem que é interno ao canal microfluídico e um eletrodo alvo que é externo ao dispositivo (neste caso, o parafuso de cabeça no modelo animal). A taxa de entrega de fármacos é proporcional à tensão aplicada e à corrente medida entre os eletrodos de origem e alvo. A tunabilidade precisa da entrega de fármacos é uma das principais vantagens do μFIP. Outra vantagem crítica, em comparação com os sistemas de entrega de drogas fluídico ou à base de pressão, é que no μFIP há apenas um aumento de pressão insignificante na tomada de entrega de medicamentos, pois as drogas são entregues em todo o IEM sem sua solução transportadora.

Há uma pequena quantidade de vazamento passivo de GABA quando o μFIP é “desligado”, mas isso foi encontrado para não efeito SLEs. O μFIP é feito medida seguindo métodos convencionais da microfabricação que nós relatamos previamente³¹.

Desde que uma maneira de impedir apreensões periódicas é o bloqueio de descargas da rede no início ou mesmo antes do primeiro evento da apreensão, o método apresentado para entregar o neurotransmissor inibidor GABA no foco epileptic tem grande potencial terapêutico para o controle da apreensão nos pacientes com epilepsia focal. Como o GABA é um substrato endógeno, ele deixa Propriedades neuronais intrínsecas inalteradas em concentrações fisiológicas. A aplicação local de baixos níveis de GABA só afetará as células naturalmente sensíveis à inibição, e só vai causar efeitos semelhantes à inibição fisiológica, ao contrário da estimulação cerebral profunda (DBS), que tem ações inespecíficas, estimulando todas as células da rede neuronal em seu ambiente, causando uma resposta misturada que envolve a excitação e a inibição. Em conclusão, o método proposto fornece uma abordagem mais específica para o controle de crises do que o DBS.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes éticas do Institut de NEUROSCIENCES des Systèmes e aprovados pelos comitês de ética e escritórios veterinários locais. Nota: Dezessete machos adultos OF1 camundongos foram utilizados para os experimentos. Camundongos foram arrastada para um ciclo de luz/escuro 12 h com alimentos e água disponível ad libitum. 1. anestesia Injete intraperitonea…

Representative Results

Usando o procedimento apresentado aqui com um modelo da epilepsia 4AP em ratos anestesiados, o controle de apreensões epileptic pode ser conseguido no foco epileptic. A localização precisa dos implantes (Figura 2) ajudou a registrar potenciais de campo hipocampal local (lfps, Figura 4), para induzir pequenas convulsões hipocampais e para entregar GABA no início da apreensão. A localização dos implantes foi verificada apó…

Discussion

Desenvolvendo um protocolo experimental novo em um modelo agudo do rato da epilepsia, SLEs poderia com sucesso ser controlado com a ajuda de um μFIP implantado no foco epileptic. Os agradecimentos a sua capacidade para entregar GABA com precisão temporal e espacial, SLEs 4AP-induzidos foram controlados no início das apreensões. O tratamento da epilepsia é teoricamente possível se o controle das descargas da rede neural é conseguido no lugar do começo da apreensão. O protocolo apresentado provou isso possível se…

Materials

4AP	Sigma	275875
Alexa Fluor 488	Abcam	ab15007
Amplifier	Neuralynx, Montana, USA	Digital Lynx 4SX
Amplifier	Ampliplex	KJE-1001
Atlas Stereotaxique	Allen Atlas	978-0470054086
Borosilica glass pipette	Sutter	BF120-69-15
Brain Matrix	WPI	RBMA-200C
Bone trimmer	FST	16109-14
Confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Connector	INSTECH	SC20/15
Coton tige	Monoprix	EMD 6107OD
Cover slip	Menzel-Glass	15747592
DiI Stain	Thermo Fisher	D282
DMSO	Sigma	11412-11
Drill	FOREDOM	K1070
Forceps	F.S.T.	11412-11
GABA	Sigma	A2129
GFAP Monoclonal Antibody	Thermofisher	53-9892-80
GOPS	Sigma	440167-100M
Hamilton seringe	Hamilton	80330
Headscrew	Component Supply	TX00-2FH
Heating pad	Harvard apparatus	341446
Injection Pump	WPI	UMP3-3
Keithley	Tektoronix	216A
Ketamine	Renaudin	5787419
Magnetic holder	Narishige	GJ-1
Mice	Charles River	612
Motoric manipulator	Scientifica, UK	IVM
Na2HPO4	Sigma	255793
NaH2PO4	Sigma	7558807
NeuroTrace DiI	Thermofisher	N22880
Paper towel	KIMBERLY CLARK	7552000
PB	Sigma	P4417
PEDOT:PSS	CLEVIOS	81076212
PFA	Acros Organic	30525-89-4
Rectal temperature probe	Harvard apparatus	521591
Ropivacaine	KABI	1260216
Saline	Sigma	7982
Scalpel	F.S.T	AUST R195806
Seringue	BD Medical	324826
Serrefine clamp	F.S.T	18050-28	4 is recommended
Silicon probe	NeuroNexus, Michigan, USA	A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703
Stereotoxic frame	Stoelting	51733U
Superfrost Slide	ThermoScientific	J38000AMNZ
Tubing	INSTECH	LS20
Vaseline	Laboratoire Gilbert	3518646126611
Vectashield DAPI	Vector Laboratories, California, USA	H-1200-10
Vibratome, Leica VT1200S	Leica Microsystems	1491200S001
Xylazine	Bayer	4007221032311