In dit manuscript opgericht wij een hoge doorvoersnelheid methode om te kwantificeren van alkalische fosfatase activiteit in S. aureus biofilm cultuur van weefselkweek 96-wells-plaat
Alkalische fosfatase (ALP) is een gemeenschappelijk enzym uitgedrukt in zowel prokaryote en eukaryote cellen. Het katalyseert de hydrolyse van fosfaat monoesters uit veel moleculen met een pH van fundamentele en speelt een onmisbare rol in het metabolisme van fosfaat. Bij de mens is eukaryote ALP een van de meest gebruikte enzymatische signalen in de diagnose van verschillende ziektes zoals cholestase en rachitis. In S. aureus, ALP wordt gedetecteerd uitsluitend op de celmembraan; het wordt ook uitgedrukt als een secretoire vorm ook. Nog, er is weinig bekend over de functie bij de vorming van biofilms.
Het doel van dit manuscript is om een snelle en betrouwbare test voor het meten van de ALP activiteit in S. aureus biofilm die geen eiwit isolatie vereist. Met behulp van p-nitrofenyl fosfaat (pNPP) als substraat, we gemeten ALP activiteit in S. aureus biofilm gevormd in de weefselkweek 96-wells-platen. Activiteit is gebaseerd op de vorming van de oplosbare reactieproduct gemeten door absorptie van 405 nm. De aard van de hoge doorvoer van de methode van de plaat 96 goed weefselkweek biedt een gevoelige en reproduceerbare methode voor ALP activiteit testen. Hetzelfde experimentele instellen kan ook worden uitgebreid tot andere extracellulaire moleculaire merkers aan biofilm vorming gerelateerde meten.
Alkalische fosfatase (ALP) is overal uitgedrukt in zowel prokaryote en eukaryote cellen1. Het kan het katalyseren van de hydrolyse van monofosfaat uit verschillende moleculen zoals nucleotiden, eiwitten, alkaloïden, fosfaatesters en afgeleide anhydriden van fosforzuur. Bij de mens is eukaryote ALP aanwezig in vele weefsels, waaronder bot, lever, darm en placenta2. Het speelt een belangrijke rol in proteïne fosforylatie, celgroei, apoptosis, stamcel processen evenals normale skelet mineralisatie. Eukaryotische ALP is ook een belangrijke serum-indicator voor de aanwezigheid van ziekten in bot, lever en andere weefsels/organen wanneer verhoogde3,4.
Prokaryote ALP is geconstateerd in een verscheidenheid van bacteriële cellen, met inbegrip van E. coli5, S. aureus6,7 en sommige gemeenschappelijke pens bacteriën in de bodem-8. Bacteriële ALP activiteit is gebruikt als een biosensor in de detectie van bacteriële besmetting10, pesticiden en zware metalen9 . De constitutieve uitdrukking van ALP is gebruikt om te identificeren van de staphylococcen11 en Serratia onderscheiden van Enterobacter12. Verder wordt voorgesteld dat de constitutieve ALP productie is gecorreleerd met pathogeniteit in staphylokokken13. Hoewel ALP is onderzocht in verschillende instellingen,3,4, is nog weinig gerapporteerd voor de activiteit en de functie in biofilms culturen.
Een biofilm heeft gedocumenteerd te hebben een verschillend functionerende bacteriële leven ten opzichte van haar free-living bacteriële cel tegenhanger14. In S. aureus, is de vorming van een biofilm geconstateerd in een verscheidenheid van klinische omstandigheden en rekeningen voor de resistentie tegen antibiotica en chronische ontsteking15,16. Veel moleculen te vinden in een biofilm matrix zoals polysacchariden, eiwitten, nucleïnezuren en lipiden had gemeld, maar het mechanisme van biofilm vorming is niet volledig begrepen14. Om te begrijpen van de rol van ALP in biofilm vorming, we gekweekt van S. aureus biofilms in 96 goed weefselkweek platen en de activiteit van de ALP met behulp van para-nitrophenylphosphate (pNPP) gemeten.
De pNPP van het molecule is een kant-en-klare substraat voor ALP en is wijd verbeid gebruikt voor het meten van de ALP activiteit6,17,18. Deze colorimetrische bepaling is gebaseerd op de omzetting van para-nitrofenyl fosfaat (pNPP) te para-nitrofenol, resulterend in een gekleurd product op 405 nm. Vergeleken met andere conventionele ALP assay, zoals agarose gel elektroforese19, tarwekiemen agglutinin (WGA) neerslag, en WGA-HPLC20, deze test zeer specifiek is, zorgt gevoelig, gemakkelijk te reproduceren, en de meeste bovenal voor hoge doorvoer.
In onze assay gebruikten we pNPP als de ALP substraat. Dit is een werkende oplossing ontworpen voor ELISA en niet te worden verdund. Na hydrolyse door ALP, een gele product ontwikkelt en kan worden gemeten op 405 nm. Aan het einde van de enzymatische reactie, we kort de 96 goed plaat gecentrifugeerd en het supernatant overgebracht naar een verse 96 goed plaat voor het meten van de absorptie met behulp van de-afleesapparaat. We vonden dat deze extra centrifugeren stap is van cruciaal belang, aangezien hierdoor de samenhan…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken William Rainey Harper College en de Universiteit van Illinois in Chicago voor de mogelijkheid om de uitvoering van deze experimenten. Wij danken ook McGraw Hill Foundation voor hun gulle steun.
Agar | VWR | 9002-18-0 | |
Eppendorf Centrifuge | Thomas Scientific | 5810 | |
Gluose | VWR | 50-99-7 | |
NaOH pellets | VWR | SS0550-500GR | |
Para-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | P7998-100ML | Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature. |
10X PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 |
Sigma | P3288-1VL | |
Plate Reader | Biotek | ELx808 | |
S. aureus | ATCC | ATCC25923 | |
Tryptic Soy Agar 15g / L TSB | VWR | 9002-18-0 | |
Tryptic Soy Broth: g/L Pancreatic Digest of Casein………… 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal………5.00 Sodium chloride………………………… 3.00 Dextrose…………………………………. 2.50 Dipotassium phosphate………………2.50 |
VWR | 90006-098 | |
96 well tissue culture plates | BD | 6902D09 | U shaped bottom |