В этой рукописи мы создали метод высокую пропускную способность для количественного определения активности щелочной фосфатазы в S. aureus биопленки культуры от 96-луночных культуры ткани пластины
Щелочная фосфатаза (ALP) является общим фермент выразил в клетках прокариот и эукариот. Он катализирует гидролиз фосфат monoesters от многих молекул базовых pH и играет незаменимую роль в метаболизме фосфат. В организме человека эукариотических ALP является одним из наиболее часто используемых ферментативные сигналов в диагностики различных заболеваний, таких как холестаза и рахита. В S. золотистого стафилококка, ALP обнаруживается исключительно на клеточной мембраны; также выражается как секреторной формы также. Тем не менее мало что известно о ее функции в биопленки.
Цель этой рукописи заключается в разработке быстрого и надежного анализа для измерения активности ALP биопленки S. aureus , которые не требуют изоляции белка. С помощью p нитрофенил фосфат (pNPP) как субстрат, мы измерили ALP деятельность биопленки S. aureus , образованная в 96-луночных тканевой культуры пластин. Деятельность была основана на образовании продукта растворимых реакции, измеряется 405 нм поглощения. Высокая пропускная способность характер метода 96 хорошо культуры ткани пластины обеспечивает чувствительных и воспроизводимый метод для анализов деятельности ALP. То же экспериментальная Настройка также может распространяться для измерения других внеклеточного молекулярных маркеров, связанных с биопленки.
Щелочная фосфатаза (ALP) повсеместно выражается в обеих клеток прокариот и эукариот1. Он может катализировать гидролиз монофосфат от различных молекул, таких как нуклеотидов, белки, алкалоиды, фосфатные эфиры и ангидриды фосфорной кислоты. В организме человека эукариотических ALP присутствует во многих тканях, в том числе печень, кости,2кишечника и плаценты. Она играет важную роль в фосфорилирование белков, рост клеток, апоптоз, стволовых клеток процессов, а также обычных скелетной минерализации. Эукариотические ALP также является показателем ключевых сыворотки на наличие заболеваний костей, печени и других тканей/органов при повышенных3,4.
Прокариот ALP был обнаружен в различных бактериальных клеток, включая E. coli5, S. aureus6,7 и некоторых распространенных бактерий рубца в почвах8. Бактериальной активности ALP был использован как биосенсора для обнаружения пестицидов, тяжелых металлов9 и10бактериального загрязнения. Учредительный выражение ALP был использован для идентификации стафилококков11 и дифференцировать Serratia Enterobacter12. Далее предлагается, что учредительный ALP производства связана с патогенностью стафилококки13. Хотя ALP был изучен в различные параметры3,4, еще мало сообщается, для его деятельности и функции в биопленке культур.
Биопленки были задокументированы, чтобы иметь по-разному функционирования бактериальной жизни по сравнению с его коллегой Свободноживущие бактериальной клетке14. В S. aureusобразование биопленки была выявлена в различных клинических условий и счетам по антибиотикорезистентности и хроническое воспаление15,16. Было сообщено много молекул можно найти в матрицу биопленки например полисахаридов, белков, нуклеиновых кислот и липидов, но механизм биопленки не полностью понял14. Чтобы понять роль ALP в биопленки, мы культивировали S. aureus биопленки в 96 хорошо культуры ткани пластины и измеряли активность ALP, используя пункт nitrophenylphosphate (pNPP).
PNPP молекула является готовым субстрат для ALP и широко используется для измерения ALP деятельности6,17,18. Этот assay колориметрические основывается на преобразование пункт нитрофенил фосфат (pNPP) в пункт нитрофенола результате цветные продукт на 405 нм. По сравнению с другими обычными пробирного ALP, такие как гель агарозы электрофореза19, зародышей пшеницы агглютининов (WGA) осадков, и WGA-ВЭЖХ20, этот assay весьма специфический, чувствительной, легко воспроизвести и, самое главное, позволяет для высокой пропускная способность.
В нашем assay мы использовали pNPP как ALP субстрата. Это рабочее решение предназначенных для ELISA и неразбавленный необходим. После гидролиза, ALP, желтый продукт развивается и может быть измерена в 405 нм. В конце ферментативные реакции мы кратко центрифугировали 96 хорошо пластины и переданы св?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Уильям Рэйни Харпер колледж и Университет Иллинойса в Чикаго для объекта для проведения этих экспериментов. Мы также благодарим фонд McGraw Хилл за их щедрую поддержку.
Agar | VWR | 9002-18-0 | |
Eppendorf Centrifuge | Thomas Scientific | 5810 | |
Gluose | VWR | 50-99-7 | |
NaOH pellets | VWR | SS0550-500GR | |
Para-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | P7998-100ML | Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature. |
10X PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 |
Sigma | P3288-1VL | |
Plate Reader | Biotek | ELx808 | |
S. aureus | ATCC | ATCC25923 | |
Tryptic Soy Agar 15g / L TSB | VWR | 9002-18-0 | |
Tryptic Soy Broth: g/L Pancreatic Digest of Casein………… 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal………5.00 Sodium chloride………………………… 3.00 Dextrose…………………………………. 2.50 Dipotassium phosphate………………2.50 |
VWR | 90006-098 | |
96 well tissue culture plates | BD | 6902D09 | U shaped bottom |