本稿では、96-well ティッシュの培養皿から黄色ブドウ球菌のバイオ フィルム文化のアルカリフォスファターゼ活性を定量化する高スループット方法を確立しました。
アルカリフォスファターゼ (ALP) は原核生物と真核生物の細胞で発現した一般的な酵素であります。基本的な pH で多くの分子からリン酸モノエステル加水してリン酸の代謝に不可欠な役割を果たしています。ヒトでは、真核生物の ALP は、胆汁うっ滞や佝僂病などの各種疾患の診断に最も頻繁に使用される酵素の信号の一つです。S.細胞膜; 排他的に球菌ALP が検出されました。また同様に分泌形態として表されます。まだ、少しはバイオ フィルム形成の機能について知られています。
本稿の目的は、蛋白質の隔離を必要としない黄色ブドウ球菌バイオ フィルムにおける ALP 活性を測定するための迅速かつ信頼性の高いアッセイを開発することです。P-ニトロフェニル リン酸 (同時) を使用すると、基質として、96-well ティッシュの培養皿で形成された黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムにおける ALP 活性を測定しました。活動は、405 nm の吸光度を用いて水溶性反応生成物の形成に基づいていた。96 よく組織培養プレート法のスループットの高い自然は、高感度かつ再現性 ALP 活性アッセイ法を提供します。同じ実験のセットアップは、バイオ フィルム形成に関連する他の細胞外の分子マーカーを測定する拡張できます。
アルカリフォスファターゼ (ALP) 普遍的、両方の原核生物と真核生物の細胞の1で表されます。核酸、タンパク質、アルカロイド、リン酸エステル、リン酸の無水物などの異なる分子からリン酸の加水分解を触媒することができますそれ。ヒトでは、真核生物の ALP は肝臓、骨、小腸、胎盤の2を含む多くの組織に存在です。それは通常骨格鉱化作用と同様、タンパク質リン酸化、細胞増殖、アポトーシス、幹細胞プロセスで重要な役割を果たしています。真核生物の ALP はまた、骨、肝臓、そして昇格したとき他の組織/臓器の疾患の有無をキー血清指標3,4。
土8にエシェリヒア属大腸菌5、黄色ブドウ球菌6,7いくつかの共通の第一胃内細菌などの細菌細胞の様々 な原核生物の ALP が検出されました。細菌の ALP 活性は、殺虫剤、重金属9および10細菌汚染の検出バイオ センサーとして使用されています。構成式の ALP はブドウ球菌11を識別し、エンテロバクター12からセラチアを区別するために使用されています。さらに、構成の ALP 生産病原性ブドウ球菌13と相関していることをお勧めします。ALP は、異なる設定3,4、研究されているがまだ少しはその活動とバイオ フィルム文化の機能の報告されます。
バイオ フィルムは、その自由生存細菌セル対応14と比較して異なる機能細菌生命に記載されています。黄色ブドウ球菌、さまざまな臨床状態と抗生物質耐性の慢性的な炎症15,16アカウントでバイオ フィルムの形成が確認されました。多くの分子は、多糖類、タンパク質、核酸、脂質などのバイオ フィルム マトリックスに報告されていたが、バイオ フィルム形成のメカニズムは完全に理解した14。バイオ フィルム形成における ALP の役割を理解し、96 のよく組織培養皿で黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムを培養し、パラ nitrophenylphosphate (同時) を用いた ALP 活性を測定します。
分子同時は ALP のための準備ができて使用する基板を ALP 活性6,17,18を測定に広く使用されています。この比色定量法は、パラ-ニトロフェノール 405 色製品の結果にパラ-ニトロフェニル リン酸 (同時) の変換に基づいて nm。Agarose のゲルの電気泳動法19、小麦胚芽凝集素 (WGA) 沈殿物および WGA HPLC20、この試金は非常に特定のように、他の従来の alp と比較して、敏感な簡単に再現、そして最も重要なでは、高スループット。
我々 の分析では、ALP 基板に同時を使用しました。ELISA 用に設計された実用的なソリューションで、希釈する必要はありません。Alp 企業様が、加水分解後黄色製品開発し、405 で測定できる nm。酵素反応の最後に、我々 は簡単に 96 ウェル プレートを遠心分離し、上澄みをプレート リーダーを使用して吸光度を測定する新鮮な 96 well プレートに転送。それは 405 で吸光度の一貫性を増加するの…
The authors have nothing to disclose.
ウィリアム Rainey ハーパー大学とこれらの実験を行うための施設のためのシカゴのイリノイ大学に感謝します我々 はまた彼らの寛大なサポートの McGraw 丘財団を感謝します。
Agar | VWR | 9002-18-0 | |
Eppendorf Centrifuge | Thomas Scientific | 5810 | |
Gluose | VWR | 50-99-7 | |
NaOH pellets | VWR | SS0550-500GR | |
Para-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | P7998-100ML | Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature. |
10X PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 |
Sigma | P3288-1VL | |
Plate Reader | Biotek | ELx808 | |
S. aureus | ATCC | ATCC25923 | |
Tryptic Soy Agar 15g / L TSB | VWR | 9002-18-0 | |
Tryptic Soy Broth: g/L Pancreatic Digest of Casein………… 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal………5.00 Sodium chloride………………………… 3.00 Dextrose…………………………………. 2.50 Dipotassium phosphate………………2.50 |
VWR | 90006-098 | |
96 well tissue culture plates | BD | 6902D09 | U shaped bottom |