레브 면역 침전 및 질량 분광법을 통한 HIV-1 복제 중 핵균 요인 식별
Summary
여기에서 우리는 질량 분광법을 위한 HIV-1 복제의 존재에 있는 Rev 면역 침전을 기술합니다. 기재된 방법은 HIV-1 감염 주기에 관여하는 뉴클레올러 인자의 식별을 위해 사용될 수 있으며, 연구되지 않은 경로의 특성화를 위한 다른 질병 모델에 적용가능하다.
Abstract
HIV-1 전염주기는 바이러스 복제, 포장 및 방출을 촉진하기 위해 호스트 인자와의 바이러스 성 단백질 상호 작용을 필요로합니다. 전염주기는 더 접합을 통제하고 뉴클레오세포 수송을 가능하게 하기 위하여 HIV-1 RNA를 가진 바이러스성/호스트 단백질 복합체의 대형을 요구합니다. HIV-1 Rev 단백질은 인트로닉 시스-연기 표적-레브 반응 요소(RRE)를 가진 다중 병합을 통해 HIV-1 mRNAs의 핵 수출을 달성한다. 핵국화 신호(NoLS)는 레브 아르기닌이 풍부한 모티프(ARM)의 COOH 말단 내에 존재하며, 핵소체내의 Rev/RRE 복합체의 축적을 허용한다. 핵균 요인은 mRNA 독립적인 핵 수출 및 접합을 중재하는 것 이외에 각종 그밖 기능을 통해 HIV-1 전염주기를 지원하기 위하여 추측됩니다. 우리는 질량 분광법을 위한 HIV-1 복제의 존재에 있는 Rev 뉴클레올라 돌연변이 (삭제 및 단점 Rev-NoLS 돌연변이)에 비교된 야생형 (WT) Rev의 면역 침전 방법을 기술합니다. 뉴클레오세포 인자 (뉴클레오포스민 B23 및 뉴클레오린 C23)뿐만 아니라 세포 접합 인자에 연루된 핵세포 인자는 Rev-NoLS 돌연변이의 존재에서 Rev와의 상호 작용을 잃게된다. snoRNA C/D 상자 58와 같은 각종 그밖 핵포 요인은, Rev 돌연변이와의 상호 작용을 분실하기 위하여 확인됩니다, 그러나 HIV-1 복제 주기에 있는 그들의 기능은 알려지지 않은 남아 있습니다. 여기에 제시된 결과는 HIV-1 전염주기를 유지하는 바이러스성/호스트 뉴클레올라 요인의 확인을 위한 이 접근의 사용을 보여줍니다. 이 접근에 사용된 개념은 연구되지 않은 통로의 특성화를 요구하는 그밖 바이러스성 및 질병 모형에 적용가능합니다.
Introduction
핵약은 바이러스 복제에 필요한 다양한 세포 숙주 및 바이러스 인자의 상호 작용 접지로 가정됩니다. 핵소종은 세 개의 서로 다른 구획으로 세분화된 복잡한 구조입니다: 섬유실, 조밀한 섬유실 및 과립 구획. HIV-1 Rev 단백질은 특히 세분화된 구획 내에서 국소화됩니다. 그러나 이 지역화 패턴에 대한 이유는 알 수 없습니다. NoLS 서열(Rev 돌연변이 4, 5 및 6) 내의 단일 점 돌연변이가 있는 경우, Rev는 뉴클레올러 패턴을 유지하고 이전에 HIV-1HXB2 복제를 구출하는 것으로 나타났지만 WT Rev 1에 비해 효율성이 감소했습니다. . 모든 단점 돌연변이는 HIV-1NL4-3 전염주기를 지탱할 수 없습니다. NoLS 서열(Rev-NoLS 돌연변이 2 및 9) 내에서 다중 단일 점 돌연변이의 존재에서, Rev는 핵 및 세포질 전반에 걸쳐 분산되는 것으로 관찰되었으며HIV-1HXB2 복제 1을 구출할 수 없었다. 이 proteomics 연구 결과의 목표는 Rev 중재한 HIV-1 전염하는 통로에서 관련시킨 비핵구세포 세포 요인 뿐만 아니라 핵을 해독하는 것입니다. 레브 면역 침전 조건은 이전에 뉴클레오체 돌연변이의 존재하에서 Rev와의 상호 작용을 잃는 것으로 나타난 뉴클레올러 B23 인단백질과의 상호작용을 통해 최적화된다.
레브 세포 요인은 광범위하게 과거에 공부하고있다; 그러나, 이것은 바이러스성 병인의 부재에서 행해졌습니다. 특히, HIV-1 복제 시 레브 상호작용을 통한 본 연구에서 특징인 단백질 중 하나는 핵포포스민(NPM), 누마티스민 또는 NO38이라고도 불리는 핵포단백질 B23이며, 양서류 2, 3, 4. B23은 3개의 이소폼(NPM1, NPM2 및 NPM3)-핵공포증/핵샤페론 패밀리의 모든 구성원5,6으로표현된다. NPM1 분자 샤페론은 크로마틴 고차 구조에 관여하는 단백질/핵산 복합체의 형성에서 뉴클레오좀의 적절한조립에서 기능7,8,및 응집 방지 및 N-말단 코어 도메인(잔기 1-120)을 통해 표적 단백질의오실링(잔기 1-120)을 9. NPM1 기능은 핵과 세포질 사이의 프리보솜 입자의 수송을 통해 리보솜 기원으로 확장10,11,내부 전사 스페이서 서열에서 프리보솜 RNA의 처리 도 12,13,리보좀 어셈블리 동안 단백질의 뉴클레오체 응집을 체포14,15. NPM1은 세포자멸(16)의 억제및 종양 억제제 ARF17,18 및 p5319의안정화에 연루되어, 종양발생 인자 및 종양 억제제로서의 이중적 역할을 드러낸다. NPM1은 게놈 안정성, 중심도 복제 및 전사의 세포 활동에 참여한다. NPM1은 유사분열 동안 염색체 주변을 따라 세포 주기 간, 유사분열의 결론에 있는 프리뉴클레오체 체(PNB)에서 발견된다. NPM2 및 NPM3는 악성 20 동안 변경된 발현 수준을 겪는NPM1로 잘 연구되지 않습니다.
NPM1은 내부 NES 및 NLS9,21을 통해 다양한 핵/뉴클레오라단백질의 핵세포질 차단에 문서화되어 있으며 이전에 HIV-1 Tat 및 Rev 단백질의 핵 수입을 유도하는 것으로 보고되었다. B23 결합-도메인-β-갈락토시다아제 융합 단백질의 존재하에서, Tat는 세포질 내의 국소화하고 과활성화 활성을 잃는다; 이것은 B23 2에 대한 Tat의강한 친화력을 보여줍니다. 또 다른 연구는 RRE 함유 mRNA의 부재에 있는 Rev/B23 안정한 복합체를 설치했습니다. RRE mRNA의 존재에서, 레브는 B23로부터 해리되고 바람직하게는 HIV RRE에 결합하여, B2322의변위를 이끌어 내다. 그것은 어디 알 수 없습니다., 핵 수준에서, Tat 트랜스 활성화 및 HIV mRNA에 대 한 B23의 Rev 교환 프로세스가 일어나는. 두 단백질은 B23 상호 작용을 통해 동시에 핵균을 입력하는 가정. HIV 뉴클레올러 경로에서 다른 숙주 세포 단백질의 참여가 예상된다. 이 proteomics 조사에 기술된 방법은 HIV-1 병인성 도중 관련시킨 호스트 세포 요인과 핵소동의 상호 작용을 설명하는 것을 도울 것입니다.
프로테오믹스 조사는 HIV-1HXB2 생산을 위한 Rev NoLS 단점 돌연변이 (M4, M5 및 M6) 및 다중 아르기닌 치환 (M2 및 M9)의 발현을 통해 시작되었다. 이 모델에서, Rev 결핍 HIV-1 HXB2(HLfB)를 안정적으로 발현하는 HeLa 세포주들은 3′ 말단에 플래그 태그를 함유하는 WT Rev 및 Rev 뉴클레올라 돌연변이로 형질이 된다. WT Rev의 존재는 레브 결핍(M2 및 M9)을 구출하지 않는 Rev-NoLS 돌연변이에 비해 HLfB 배양물에서 바이러스 복제가 발생하도록 허용하거나, 바이러스 복제가 WTRev(M4, M5 및 M6)만큼 효율적이지는 않지만 발생하도록 허용한다 1. 세포 용해는 Rev 발현의 존재에서 바이러스 증식 후 48 시간 후에 수집되고 Rev/B23 상호작용에 최적화된 용해 완충액으로 면역 침전을 행하였다. 다양한 염 농도를 이용한 용해 완충최적화가 설명되고, HIV-1 Rev에 대한 단백질 용출 방법을 은염색 또는 쿠마시 스테인드 SDS-PAGE 겔로 비교 및 분석한다. 첫번째 proteomics 접근은 탠덤 질량 분광법에 의하여 표현된 WT Rev, M2, M6 및 M9에서 용출된 견본의 직접적인 분석을 관련시킵니다. WT Rev, M4, M5 및 M6의 용출액이 겔 추출 과정을 거치는 제2 접근법은 제1 접근법과 비교된다. 펩티드 친화성은 WT 레브에 비해 Rev-NoLS 돌연변이에 대한 단백질 동정 확률이 표시된다. 이 접근은 HIV-1 mRNA 수송에 참여하고 HIV-1 복제 도중 Rev를 가진 접합하는 잠재적인 요인 (핵소와 비핵볼라)를 밝힙니다. 전반적으로, 기술된 세포 용해, IP 및 용출 조건은 감염경로를 활성화하고 조절하는 숙주 세포 인자의 이해를 위해 관심 있는 바이러스 성 단백질에 적용가능하다. 이것은 또한 다양한 질병 모델의 지속성에 필요한 세포 숙주 인자의 연구에 적용 가능하다. 이 프로테오믹스 모델에서, HIV-1 Rev IP는 B23 상호작용에 최적화되어 핵세포질 차단 활성 및 HIV-1 mRNA 결합에 관여하는 핵세포 인자를 해명한다. 추가적으로, 관심 있는 중요한 단백질을 위한 결핍되는 감염성 질병 모형을 안정적으로 표현하는 세포주는 관심있는 감염통로를 공부하기 위하여 HLfB 세포주와 유사하게, 개발될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
HIV-1의 존재 에서 Rev-NoLS 돌연변이 및 WT Rev를 비교한 질량 분광 분석은 바이러스 복제 주기에서 관련시킨 뉴클레오요인을 이해하기 위하여 평가되었다. 이것은 바이러스성 감염에 필요한 핵성분을 확인할 것입니다. 뉴클레올러 B23은 Rev-NoLS에 대한 높은 친화력을 가지며, 레브-바운드 HIV mRNAs22의레브-NoLS 및 뉴클레오라국소화 및 뉴클레오세포국질 수송에서의 기능을 가지고 있다.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 국립 보건원 (NIH) 에이즈 연구 및 참조 시약 프로그램, 에이즈의 부서, 알레르기 및 전염성 의 국립 연구소에서 제공하는 HLfB 준수 문화에 대한 박사 바바라 K. 펠버와 박사 조지 N. 파블라키스를 인정 질병 (NIAID), NIH. 저자는 또한 NIH, 그랜트 AI042552 및 AI029329에서 제공하는 금융 소스를 인정합니다.
Materials
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-212 | |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Acrylamide:Bisacrylamide | BioRad | 1610158 | |
| Ammonium bicarbonate | Fisher Chemical | A643-500 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| ANTI-Flag M2 affinity gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| BioMax MS film | Carestream | 8294985 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL | Bio-Rad | 5000006 | |
| B23 mouse monoclonal IgG | Santa Cruz Biotechnologies | sc-47725 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| Carnation non-fat powdered milk | Nestle | N/A | |
| Cell scraper | ThermoFisher Scientific | 179693PK | |
| C18IonKey nanoTile column | Waters | 186003763 | |
| Corning 100-mm TC-treated culture dishes | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| Dithiothreitol | Thermo Scientific | J1539714 | |
| 1 x DPBS | Corning | 21-030-CVRS | |
| ECL Estern blotting substrate | Pierce | 32106 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Chemical | A409-4 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | |
| GelCode blue stain reagent | ThermoFisher | 24590 | |
| Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | |
| goat-anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2005 | |
| Iodoacetamide | ACROS Organics | 122270050 | |
| KimWipe delicate task wiper | Kimberly Clark Professional | 34120 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| NanoAcuity UPLC | Waters | N/A | |
| Pierce Silver Stain Kit | Thermo Scientific | 24600df | |
| 15-mL Polypropylene conical tube | Falcon | 352097 | |
| Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | Thermo Scientific | 26616 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 4693132001 | |
| Purified BSA | New England Biolabs | B9001 | |
| PVDF Western blotting membrane | Roche | 3010040001 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| 10 x TBS | Fisher Bioreagents | BP2471500 | |
| TEMED | BioRad | 1610880edu | |
| Triton X-100 detergent solution | BioRad | 1610407 | |
| Trizaic source | Waters | N/A | |
| trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CIS | |
| Tween 20 | BioRad | 1706531 | |
| Synapt G2 mass spectrometer | Waters | N/A | |
| Whatman filter paper | Tisch Scientific | 10427813 |
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