Summary

Une description colorimétrique de l'activité de Synthase Citrate dans Drosophila Melanogaster

Published: January 16, 2020
doi:

Summary

Nous présentons un protocole pour un test colorimétrique de l’activité de synthase de citrate pour la quantification de la masse mitochondriale intacte dans les homogénéités de tissu de Drosophila.

Abstract

Les mitochondries jouent les rôles les plus importants dans le métabolisme cellulaire en produisant de l’ATP par phosphorylation oxydative et en régulant une variété de processus physiologiques. Le dysfonctionnement mitochondrial est une cause primaire d’un certain nombre de maladies métaboliques et neurodégénératives. Les mitochondries intactes sont essentielles à leur bon fonctionnement. La synthase de citrate d’enzyme est localisée dans la matrice mitochondriale et peut ainsi être employée comme marqueur quantitatif d’enzyme de la masse mitochondriale intacte. Étant donné que de nombreuses molécules et voies qui ont des fonctions importantes dans les mitochondries sont fortement conservés entre les humains et Drosophila, et qu’un éventail d’outils génétiques puissants sont disponibles dans Drosophila, Drosophila sert de bon système modèle pour l’étude de la fonction mitochondriale. Ici, nous présentons un protocole pour la mesure rapide et simple de l’activité de synthase de citrate dans l’homogénéisation de tissu des mouches adultes sans isoler des mitochondries. Ce protocole convient également à la mesure de l’activité de synthase de citrate dans les larves, les cellules cultivées et les tissus mammifères.

Introduction

Les mitochondries sont surtout connues comme les organites producteurs d’énergie dans la plupart des organismes eucaryotes, qui produisent la monnaie de l’énergie, l’ATP, à travers le cycle de l’acide tricarboxylique (c.-à-d. le cycle Debs) et la phosphorylation oxydative. Les mitochondries jouent également un rôle important dans un grand nombre d’autres processus physiologiques, tels que la régulation de l’apoptose1, Ca2 ‘ homéostasie2,3, espèces d’oxydation réactive (ROS) génération4, et réticulum endoplasmique (ER)-réponse au stress5. Le dysfonctionnement mitochondrial peut affecter n’importe quel organe dans le corps à n’importe quel âge et est une cause primaire des maladies métaboliques, liées au vieillissement6,et neurodegenerative7. Les mitochondries intactes sont mécanistes liées à la fonction mitochondriale. Ainsi, la quantification appropriée de la masse mitochondriale intacte est très importante pour évaluer la fonction mitochondriale8. La synthase de citrate, une enzyme de limitation de taux dans la première étape du cycle d’acide tricarboxylique9,est localisée dans la matrice mitochondriale dans les cellules eucaryotes, et peut ainsi être employée comme marqueur quantitatif pour la présence de la masse mitochondriale intacte9,10. L’activité de synthase de citrate peut également être employée comme facteur de normalisation pour les protéines mitochondriales intactes11,12.

La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, est un excellent système modèle pour l’étude de la fonction mitochondriale, comme de nombreuses molécules et les voies qui jouent des rôles pivots dans les mitochondries sont évolutivement conservés de Drosophila à l’homme13,14,15. Ici, nous présentons un protocole pour une méthode rapide et simple pour la mesure de l’activité de synthase de citrate par un test colorimétrique dans le tissu de Drosophila homogénéise16 dans un format de plaque de puits 96. Dans l’analyse de l’activité de synthase de citrate, la synthase de citrate dans le tissu de Drosophila homogénéise catalyse la réaction de l’oxaloacetate avec la coenzyme acétyle A (acétyl CoA) pour former le citrate CoA-SH etH. CoA-SH réagit par la suite avec 5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) pour générer un produit coloré, 2-nitro-5-thiobenzoate (TNB), qui peut être facilement mesuré spectrophotometrically à 412 nm. L’activité de synthase de citrate peut être reflétée par le taux de production de couleur.

Protocol

1. Colorimétrique Citrate Synthase Activity Assay pour D. melanogaster16 Recueillir dix mouches adultes pour chaque échantillon. Recueillir au moins des échantillons tripler pour chaque génotype. Préparer 500 l de tampon d’extraction à froid contenant 20 mM HEPES (pH à 7,2), 1 mM EDTA et 0,1 % de triton X-100 dans un tube à essai de 1,5 mL pour chaque échantillon. Anesthésier les mouches adultes avec du CO2 sur un coussin et isoler les ti…

Representative Results

La figure 1 présente un exemple des courbes cinétiques de l’absorption de l’OD à 412 nm au fil du temps obtenue s’appuyant sur l’analyse colorimétrique de l’activité de synthase de citrate pour mesurer les homogénéités du tissu thorax Drosophila de différents génotypes. Il est bien connu que PGC-1 est un régulateur principal de la biogenèse mitochondriale. PgC-1 est fonctionnellement conservé entre la drosophile et l’homme. …

Discussion

Les études métaboliques utilisant Drosophila comme modèle doivent prendre en considération le fond génétique, l’alimentation, et l’entretien de stock des mouches18. Afin d’éviter les effets de différents milieux génétiques sur la mesure de l’activité de la synthase du citrate, différentes souches de Drosophila doivent être rétrocroisées à la souche témoin pendant 10 générations. Le fond génétique de toutes les souches de Drosophila utilisées dans no…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par les subventions de la National Natural Science Foundation of China (31401013 et 31471010), de la Science and Technology Commission of Shanghai Municipality, du Shanghai Pujiang Program (14PJ1405900) et de la Natural Science Foundation of Shanghai (19ZR1446400).

Materials

2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich V900477
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) Sigma-Aldrich V900483
Acetyl-CoA Sigma-Aldrich A2181
Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) Sigma-Aldrich D8130
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich V900106
Oxaloacetate Sigma-Aldrich O4126
Pellet pestle Sangon F619072
Pellet pestle motor Tiangen OSE-Y10
Plate reader BioTek Eon
Protein BCA Assay kit Beyotime P0010S
Scissors WPI 14124
Triton X-100 Sangon A110694-0100

References

  1. Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
  2. Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. 유전학. 201 (4), 1453-1466 (2015).
  3. Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
  4. Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers!. Frontiers in Genetics. 7, 161 (2016).
  5. Kim, H. E., et al. Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response. Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).
  6. Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).
  7. Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson’s model. Cell Death & Disease. 5, e984 (2014).
  8. Tronstad, K. J., et al. Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content. Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).
  9. Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: structure, control, and mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
  10. Lopez-Lluch, G., et al. Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).
  11. MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
  12. Gillen, J. B., et al. Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment. PLoS One. 11 (4), e0154075 (2016).
  13. Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein. Frontiers in Genetics. 5, 216 (2014).
  14. Mukherjee, S., Duttaroy, A. Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila. 유전학. 195 (2), 433-441 (2013).
  15. Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).
  16. Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
  17. Wei, P., et al. RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).
  18. Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
  19. Bosco, G., et al. Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).

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Cite This Article
Wei, P., Liu, Q., Xue, W., Wang, J. A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (155), e59454, doi:10.3791/59454 (2020).

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