Un saggio colorimetrico dell'attività Citrate Synthase in Drosophila Melanogaster
Summary
Vi presentiamo un protocollo per un saggio colorimetrico di attività di sinteassi citrate per la quantificazione della massa mitocondriale intatta negli omogenei del tessuto della Drosophila.
Abstract
I mitocondri svolgono i ruoli più importanti nel metabolismo cellulare producendo ATP attraverso la fosfororylazione ossidativa e regolando una varietà di processi fisiologici. La disfunzione mitocondriale è una causa primaria di una serie di malattie metaboliche e neurodegenerative. I mitocondri intatti sono fondamentali per il loro corretto funzionamento. L’enzima citrato synthasi è localizzato nella matrice mitocondriale e quindi può essere utilizzato come un marcatore enzimatico quantitativo di massa mitocondriale intatta. Dato che molte molecole e percorsi che hanno importanti funzioni nei mitocondri sono altamente conservati tra gli esseri umani e la Drosophila, e che una serie di potenti strumenti genetici sono disponibili in Drosophila, la Drosophila serve come un buon sistema modello per studiare la funzione mitocondriale. Qui, presentiamo un protocollo per la misurazione rapida e semplice dell’attività di sintetazione della citrata nell’omogenea tissutale da mosche adulte senza isolare i mitocondri. Questo protocollo è adatto anche per misurare l’attività di sintetasi citrate in larve, cellule coltivate e tessuti mammiferi.
Introduction
I mitocondri sono meglio conosciuti come gli organelle che producono energia nella maggior parte degli organismi eucarioti, che producono la valuta energetica, ATP, attraverso il ciclo dell’acido tricarboxylico (cioè il ciclo di Krebs) e il ciclo osofoso. I mitocondri si trovano anche a svolgere un ruolo importante in molti altri processi fisiologici, come la regolazione dell’apoptosi1, Ca 2 omeostasi2,3, specie reattiva di ossidazione (ROS) generazione4e reticolo endoplasmico (ER)-risposta di stress5. La disfunzione mitocondriale può colpire qualsiasi organo nel corpo a qualsiasi età ed è una causa primaria di metabolica, invecchiamento6e malattie neurodegenerative7. I mitocondri intatti sono meccanicamente correlati alla funzione mitocondriale. Pertanto, una corretta quantificazione della massa mitocondriale intatta è molto importante per valutare la funzione mitocondriale8. Citrate synthase, un enzima che limita il tasso nella prima fase del ciclo di acido tricarboxylico9, è localizzato nella matrice mitocondriale all’interno delle cellule eucariotiche, e quindi può essere utilizzato come marcatore quantitativo per la presenza di massa mitocondriale intatta9,10. L’attività synthase citrato può anche essere utilizzata come fattore di normalizzazione per proteine mitocondriali intatte11,12.
La mosca della frutta, Drosophila melanogaster, è un ottimo sistema modello per studiare la funzione mitocondriale, come molte molecole e percorsi che svolgono ruoli fondamentali nei mitocondri sono evolutivamente conservati dalla Drosophila agli esseri umani13,14,15. Qui, presentiamo un protocollo per un metodo semplice e veloce per la misurazione dell’attività di sinteassi citrati da un saggio colorimetrico in omogenato del tessuto della Drosophila 16 in un formato 96 beh piastra. Nel saggio di attività di sintetzia citrato, citrato synthase nel tessuto di Drosophila omogenato cala la reazione di osaloaceta con coenzima acetil A (acetyl CoA) per formare il citrate CoA-SH e H. CoA-SH reagisce successivamente con 5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) per generare un prodotto colorato, 2-nitro-5-thiobenzoate (TNB), che può essere facilmente misurato spettrometricamente a 412 nm. L’attività synthasi citrata può essere riflessa dal tasso di produzione del colore.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli studi metabolici che utilizzano la Drosophila come modello devono prendere in considerazione il background genetico, la dieta e il mantenimento delle scorte delle mosche18. Per evitare gli effetti di diversi background genetici sulla misurazione dell’attività synthase citrato, diversi ceppi di Drosophila dovrebbero essere riincrociati al ceppo di controllo per 10 generazioni. Il background genetico di tutti i ceppi di Drosophila utilizzati nei nostri esperimenti è …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (31401013 e 31471010), della Science and Technology Commission del comune di Shanghai, del Programma Shanghai Pujiang (14PJ1405900) e della Natural Science Foundation di Shanghai (19-R1446400).
Materials
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
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