果蝇梅拉诺加斯特的锡酸盐合成酶活性的色度测定
Summary
我们提出了一种对胆酸合成酶活性的色度测定方案，用于定量果蝇组织均质中完整的线粒体质量。
Abstract
线粒体在细胞代谢中起着最突出的作用，通过氧化磷酸化产生ATP并调节各种生理过程。线粒体功能障碍是许多代谢和神经退行性疾病的主要原因。完整的线粒体对其正常功能至关重要。酶Citrate合成酶在线粒体基质中局部化，因此可用作完整线粒体质量的定量酶标记。鉴于许多在线粒体中具有重要功能的分子和途径在人类和果蝇之间高度保存，并且果蝇体内有一系列强大的遗传工具，果蝇是研究线粒体功能的良好模型系统。在这里，我们提出了一个协议，用于快速和简单地测量在组织同质体中与成苍蝇的胆酸合成酶活性，而无需隔离线粒体。该协议也适用于测量幼虫、培养细胞和哺乳动物组织中的锡酸盐合成酶活性。
Introduction
线粒体在大多数真核生物中最出名的是产生能量的细胞器，它通过三甲苯酸循环（即克雷布斯循环）和氧化磷酸化产生能量货币ATP。线粒体在许多其他生理过程中也起着重要作用，如细胞凋亡1，Ca2+平衡2，3，反应性氧化物种（ROS）第4代，和内质神经素（ER）-应激反应5。线粒体功能障碍可以影响身体的任何器官在任何年龄，是代谢，老化相关6，和神经退行性疾病7的主要原因。完整的线粒体与线粒体功能有机械关系。因此，正确定量完整的线粒体质量对于评价线粒体功能8非常重要。Citrate合成酶是三聚体酸循环9第一步的速率限制酶，在真核细胞内的线粒体基质中局部化，因此可用作完整线粒体质量9、10存在的定量标记。锡酸盐合成酶活性也可用作完整线粒体蛋白11、12的正常化因子。
果蝇，果蝇，果蝇黑色素，是研究线粒体功能的一个很好的模型系统，因为许多分子和途径，在线粒体中起着关键作用，从果蝇进化保存到人类13，14，15。在这里，我们提出了一种快速而简单的方法，通过果蝇组织中的色度测定以96孔板格式对质16进行色度测定，以快速而简单的方法测量锡酸盐合成酶活性。在锡酸盐合成酶活性测定中，果蝇组织中的锡酸合成酶均质化酶催化草酸与乙酰辅酶A（乙酰CoA）的反应，形成锡酸盐CoA-SH和H+。CoA-SH 随后与 5，5′-dithiobis-（2-硝基苯甲酸） （DTNB） 发生反应，以生成彩色产品，2-硝基-5 硫苯甲酸酯 （TNB），可在 412 nm 处轻松测量分光光度。色酸盐合成酶活性可以通过颜色生产速率来反映。
Protocol
Representative Results
Discussion
以果蝇为模型的代谢研究必须考虑到苍蝇的遗传背景、饮食和种群维持。为了避免不同遗传背景对锡酸盐合成酶活性的测量的影响，不同的果蝇菌株应回到10代的对照菌株。实验中使用的所有果蝇菌株的遗传背景是w1118，所以我们用w1118作为对照。一般来说，我们认为w1118是一个很好的控制，因为它是大多数果蝇<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家自然科学基金（31401013和31471010）、上海市科委、上海浦江计划（14PJ1405900）和自然科学基金的资助。上海 （19ZR1446400）。
Materials
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
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