Um ensaio colorimétrico da atividade de sinteta de citrato em Drosophila Melanogaster
Summary
Apresentamos um protocolo para um ensaio colorirétrico da atividade de sintese de citrato para quantificação de massa mitocondrial intacta no tecido Drosophila homogeneia.
Abstract
Mitocôndrias desempenham os papéis mais proeminentes no metabolismo celular, produzindo ATP através da fosforia oxidativa e regulação de uma variedade de processos fisiológicos. A disfunção mitocondrial é a principal causa de uma série de doenças metabólicas e neurodegenerativas. Mitocôndrias intactas são fundamentais para o seu bom funcionamento. A enzima citrato synthase é localizada na matriz mitocondrial e, portanto, pode ser usada como um marcador de enzima quantitativa de massa mitocondrial intacta. Dado que muitas moléculas e vias que têm funções importantes nas mitocôndrias são altamente conservadas entre humanos e Drosophila,e que uma série de poderosas ferramentas genéticas estão disponíveis em Drosophila, Drosophila serve como um bom sistema de modelo para estudar a função mitocondrial. Aqui, apresentamos um protocolo para a medição rápida e simples da atividade de sintese de citrato no tecido homogeneado de moscas adultas sem isolar mitocôndrias. Este protocolo também é adequado para medir a atividade de sintese de citrato em larvas, células cultivadas e tecidos de mamíferos.
Introduction
As mitocôndrias são mais conhecidas como organelas produtoras de energia na maioria dos organismos eucarióticos, que produzem a moeda energética, atp, através do ciclo de ácido tricarboxílico (ou seja, ciclo Krebs) e fosforialation oxidativo. Mitocôndrias também são encontrados para desempenhar papéis importantes em uma série de outros processos fisiológicos, tais como a regulação da apoptose1, Ca2 + homeostase2,3, espécies de oxidação reativa (ROS) geração4, e reticulum endoplasmic (ER) -resposta ao estresse5. Disfunção mitocondrial pode afetar qualquer órgão do corpo em qualquer idade e é uma das principais causas metabólicas, relacionadas ao envelhecimento6, e doenças neurodegenerativas7. Mitocôndrias intactas estão mecanicamente relacionadas à função mitocondrial. Assim, quantificação adequada da massa mitocondrial intacta é muito importante para avaliar a função mitocondrial8. A sintetização de citrato, uma enzima limitante da taxa na primeira etapa do ciclo do ácido tricarboxílico9,é localizada na matriz mitocondrial dentro das células eucarióticas e, portanto, pode ser usada como um marcador quantitativo para a presença de massa mitocondrial intacta9,10. A atividade de sintese de citrato também pode ser usada como um fator de normalização para proteínas mitocondriais intactas11,12.
A mosca da fruta, Drosophila melanogaster,é um excelente sistema modelo para estudar a função mitocondrial, como muitas moléculas e vias que desempenham papéis fundamentais na mitocôndria são evolutivamente conservados de Drosophila para os seres humanos13,14,15. Aqui, apresentamos um protocolo para um método rápido e simples para a medição da atividade de sinteta de citrato por um ensaio colorimétrico no tecido Drosophila homogeneia16 em um formato de placa de 96 poços. No ensaio de atividade de citrato synthase, citrato synthase no tecido Drosophila homogeneizar catalisa a reação de oxaloacetate com coenzima acetil A (acetil CoA) para formar o citrato CoA-SH e H+. O CoA-SH reage posteriormente com 5,5′-dithiobis(2-ácido nitrobenzoico) (DTNB) para gerar um produto colorido, 2-nitro-5-thiobenzoato (TNB), que pode ser facilmente medido espectrofotomicamente a 412 nm. A atividade de sintetizador de citrato pode ser refletida pela taxa de produção de cores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estudos metabólicos usando Drosophila como modelo devem levar em consideração o fundo genético, dieta e manutenção de estoque das moscas18. Para evitar os efeitos de diferentes origens genéticas na medição da atividade de sintese de citrato, diferentes cepas de Drosophila devem ser backcrossed para a cepa de controle por 10 gerações. O fundo genético de todas as cepas drosophila usado em nossos experimentos é w1118, por isso usamos w<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelas subvenções da National Natural Science Foundation of China (31401013 e 31471010), da Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai, do Programa Shanghai Pujiang (14PJ1405900) e da Fundação de Ciências Naturais Xangai (19ZR1446400).
Materials
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
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