Un ensayo colorimétrico de la actividad de citrato sintasa en Drosophila Melanogaster
Summary
Presentamos un protocolo para un ensayo colorimétrico de la actividad citrato sintasa para la cuantificación de la masa mitocondrial intacta en el tejido Drosophila homogeneatos.
Abstract
Las mitocondrias desempeñan el papel más prominente en el metabolismo celular mediante la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa y la regulación de una variedad de procesos fisiológicos. La disfunción mitocondrial es una causa primaria de una serie de enfermedades metabólicas y neurodegenerativas. Las mitocondrias intactas son fundamentales para su correcto funcionamiento. La enzima citrato sintasa se localiza en la matriz mitocondrial y por lo tanto se puede utilizar como un marcador de enzima cuantitativa de la masa mitocondrial intacta. Dado que muchas moléculas y vías que tienen funciones importantes en las mitocondrias están altamente conservadas entre los seres humanos y Drosophila,y que una serie de potentes herramientas genéticas están disponibles en Drosophila, Drosophila sirve como un buen sistema modelo para el estudio de la función mitocondrial. Aquí, presentamos un protocolo para la medición rápida y sencilla de la actividad citrato sintasa en el tejido homogeneizado de moscas adultas sin aislar las mitocondrias. Este protocolo también es adecuado para medir la actividad de la citrato sintasa en larvas, células cultivadas y tejidos de mamíferos.
Introduction
Las mitocondrias son más conocidas como los orgánulos que producen energía en la mayoría de los organismos eucariotas, que producen la moneda energética, ATP, a través del ciclo del ácido tricarboxílico (es decir, ciclo Krebs) y fosforilación oxidativa. Mitocondrias también se encuentran para desempeñar un papel importante en una gran cantidad de otros procesos fisiológicos, tales como la regulación de la apoptosis1, Ca2 + homeostasis2,3, especies de oxidación reactiva (ROS) generación4, y retículo endoplasmático (ER)-respuesta de estrés5. La disfunción mitocondrial puede afectar a cualquier órgano del cuerpo a cualquier edad y es una causa primaria de enfermedadmeólica, relacionada con el envejecimiento6,y enfermedades neurodegenerativas7. Las mitocondrias intactas están relacionadas mecanicísticamente con la función mitocondrial. Por lo tanto, la cuantificación adecuada de la masa mitocondrial intacta es muy importante para evaluar la función mitocondrial8. Citrato sintasa, una enzima limitante de velocidad en el primer paso del ciclo de ácido tricarboxílico9, se localiza en la matriz mitocondrial dentro de las células eucariotas, y por lo tanto se puede utilizar como un marcador cuantitativo para la presencia de masa mitocondrial intacta9,10. La actividad de la citrato sintasa también se puede utilizar como factor de normalización para las proteínas mitocondriales intactas11,12.
La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, es un excelente sistema modelo para el estudio de la función mitocondrial, ya que muchas moléculas y vías que desempeñan papeles fundamentales en las mitocondrias se conservan evolutivamente desde Drosophila a los seres humanos13,14,15. Aquí, presentamos un protocolo para un método rápido y simple para la medición de la actividad citrato sintasa mediante un ensayo colorimétrico en tejido Drosophila homogeneiza16 en un formato de placa de 96 pozos. En el ensayo de actividad de citrato sintasa, citrato sintasa en el tejido drosofílico homogeneizado cataliza la reacción de oxaloacetato con acetil coenzima A (acetil CoA) para formar el citrato CoA-SH y H+. CoA-SH reacciona posteriormente con 5,5′-dithiobis-(2-ácido nitrobenzoico) (DTNB) para generar un producto de color, 2-nitro-5-tiobenzoato (TNB), que se puede medir fácilmente espectrofotométricamente a 412 nm. La actividad de la citrato sintasa puede reflejarse en la tasa de producción de color.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los estudios metabólicos utilizando Drosophila como modelo deben tener en cuenta los antecedentes genéticos, la dieta y el mantenimiento de las acciones de las moscas18. Para evitar los efectos de diferentes fondos genéticos en la medición de la actividad citrato sintasa, diferentes cepas de Drosophila deben ser retrocruzadas a la cepa de control durante 10 generaciones. El trasfondo genético de todas las cepas Drosophila utilizadas en nuestros experimentos es w…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31401013 y 31471010), la Comisión de Ciencia y Tecnología del Municipio de Shanghái, el Programa Pujiang de Shanghái (14PJ1405900), y la Fundación de Ciencias Naturales de Shanghái (19ZR1446400).
Materials
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
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