En kolorimetrisk analys av Citratsyntas aktivitet i Drosophila melanogaster
Summary
Vi presenterar ett protokoll för en kolorimetrisk analys av citratsyntas aktivitet för kvantifiering av intakt mitokondriell massa i Drosophila vävnad Homogenates.
Abstract
Mitokonbenerna spelar de mest framträdande rollerna i cellulär metabolism genom att producera ATP genom oxidativ fosforylering och reglera en mängd fysiologiska processer. Mitokondriell dysfunktion är en primär orsak till ett antal metabola och neurodegenerativa sjukdomar. Intakt mitokona är avgörande för deras korrekta funktion. Enzymet citrat syntas är lokaliserad i mitokondriell matris och därmed kan användas som en kvantitativ enzym markör för intakt mitokondriell massa. Med tanke på att många molekyler och vägar som har viktiga funktioner i mitokondrierna är starkt bevarade mellan människor och Drosophila, och att en rad kraftfulla genetiska verktyg finns tillgängliga i Drosophila, fungerar Drosophila som ett bra modellsystem för att studera mitokondriell funktion. Här presenterar vi ett protokoll för snabb och enkel mätning av citratsyntas aktivitet i vävnad homogena från vuxna flugor utan att isolera mitokonen. Detta protokoll är också lämpligt för att mäta citratsyntas aktivitet i larver, odlade celler, och däggdjursvävnader.
Introduction
Mitokondrier är mest kända som Power-producerande organeller i de flesta eukaryota organismer, som producerar energi valutan, ATP, genom trikarboxylsyracykeln Acid cykel (dvs, Krebs cykel) och oxidativ fosforylering. Mitokonskerna finns också att spela viktiga roller i en massa andra fysiologiska processer, såsom reglering av apoptos1, ca2 + homeostas2,3, reaktiv oxidation arter (ros) generation4, och endoplasmatiska nätmagen (er)-stress Response5. Mitokondriell dysfunktion kan påverka alla organ i kroppen i alla åldrar och är en primär orsak till metabola, åldrande-relaterade6, och neurodegenerativa sjukdomar7. Intakta mitokondrier är mekanistiskt relaterade till mitokondriell funktion. Sålunda, korrekt kvantifiering av intakt mitokondriell massa är mycket viktigt för att utvärdera mitokondriell funktion8. Citratsyntas, ett hastighetsbegränsande enzym i det första steget av trikarboxylsyracykeln9, lokaliseras i den mitokondriella matrisen inom eukaryota celler, och kan därför användas som en kvantitativ markör för närvaron av intakt mitokondriell massa9,10. Citratsyntas aktivitet kan också användas som en normaliserings faktor för intakta mitokondriella proteiner11,12.
Den fruktfluga, Drosophila melanogaster, är ett utmärkt modellsystem för att studera mitokondriell funktion, så många molekyler och vägar som spelar centrala roller i mitokondrier är evolutionärt bevaras från Drosophila till människor13,14,15. Här presenterar vi ett protokoll för en snabb och enkel metod för mätning av citrat syntas aktivitet genom en kolorimetrisk analys i Drosophila vävnad Homogenates16 i en 96 väl plåtformat. I citratsynthase Activity assay, citrat syntas i Drosophila vävnad Homogenatet katalyserar reaktionen av oxaloacetat med acetyl coenzym A (acetyl COA) att bilda citrat COA-sh och H+. CoA-SH reagerar därefter med 5,5 ‘-dithiobis-(2-nitrobensoesyra) (DTNB) för att generera en färgad produkt, 2-Nitro-5-thiobenzoate (TNB), som lätt kan mätas spektrofotometriskt vid 412 nm. Citratsynthase aktivitet kan återspeglas av graden av färgproduktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metaboliska studier med hjälp av Drosophila som modell måste ta hänsyn till den genetiska bakgrunden, diet, och lagerunderhåll av flugor18. För att undvika effekterna av olika genetiska bakgrunder på mätningen av citrat syntas aktivitet, olika stammar av Drosophila bör backkorsas till kontroll stammen i 10 generationer. Den genetiska bakgrunden till alla Drosophila stammar som används i våra experiment är w1118, så vi använde w11…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation i Kina (31401013 och 31471010), vetenskaps-och teknik kommissionen i Shanghai kommun, Shanghai Pujiang program (14PJ1405900), och Natural Science Foundation of Shanghai (19ZR1446400).
Materials
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
References
- Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. 유전학. 201 (4), 1453-1466 (2015).
- Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
- Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers!. Frontiers in Genetics. 7, 161 (2016).
- Kim, H. E., et al. Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response. Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).
- Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).
- Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson’s model. Cell Death & Disease. 5, e984 (2014).
- Tronstad, K. J., et al. Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content. Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).
- Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: structure, control, and mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
- Lopez-Lluch, G., et al. Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
- Gillen, J. B., et al. Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment. PLoS One. 11 (4), e0154075 (2016).
- Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein. Frontiers in Genetics. 5, 216 (2014).
- Mukherjee, S., Duttaroy, A. Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila. 유전학. 195 (2), 433-441 (2013).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
- Wei, P., et al. RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Bosco, G., et al. Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).
