Summary
הטיפול בדו משתני משתנה מספר לוקוס-repeat (MLVA) המוצג כאן מאפשר מחקר ברזולוציה גבוהה, חזק ונייד של החיידק הפתוגני של הדג. החל מתרבויות טהורות, היישום משתמש ב-PCR מולטיפלקס ובאלקטרופורזה קפילר כדי לייצר פרופילי MLVA 10-הבסים ליישומי מטה.
Abstract
Yersinia תרמילי הוא פתוגן חשוב של salmonids ברחבי העולם, אבל כלים פשוטים מתאים לחקירה אפיזוולוגית (זיהום מעקב, וכו ') של חיידק זה היו חסרים. משתנה Multi-לוקוס-מספר הטיפול מחזור דו-ממדי (MLVA) הטיפול היה ולכן פותחה ככלי נגיש בקלות חד משמעית ברזולוציה גבוהה הקלדה של מבודד התאושש. עבור שיטת ה-MLVA המוצגת כאן, ה-DNA מופק מתוך התרבית Y. תרמילי דגימות על ידי הרתיחה תאים חיידקיים במים, ואחריו שימוש של supernatant כתבנית עבור ה-PCR. פריימר-זוגות מיקוד עשרה משתנה-מספר חזרה טנדם (VNTR) המקום, בתוספת ברחבי הגנום Y. תרמילי , מופצים באופן שווה בין 2 5-plex התגובות PCR פועל תחת תנאי אופניים זהים. התחל הקדמי מתויג עם אחד משלושת צבעי פלורסנט. מוצרי PCR הבאים ממדוללים על ידי האלקטרופורזה בג, מדולל וחשופים לאלקטרופורזה בקפילר. מתוך הפרופילים electropherogram המתקבל, פסגות המייצגים כל אחד של המישוב VNTR הם בגודל שנקרא ומועסק לחישוב ספירות VNTR חוזר על-ידי סיליקו. פרופילי MLVA המתקבלים מעשר ספרות משמשים להפקת עצים מורחבים מינימליים המאפשרים הערכה אפיתיולוגית בניתוח אשכולות. נתוני פלט ניידים מאוד, בצורה של פרופילי MLVA מספריים, ניתן להשוות במהירות על פני מעבדות ולהציב הקשר הזמני. ההליך כולו מן המושבה התרבותית ועד להערכת אפיזוולוגית ניתן להשלים עד 48 Y. תרמילי בודד בתוך יום עבודה אחד.
Introduction
משפחת ירזיניה, חיידק גראם שלילי, וחבר במשפחת ירמיהו, גורם לsalmonid ברחבי העולם1. היא מאובחנת בקלות מדגים נגועים על ידי טיפוח על סוגים רבים של התקשורת אגר, אבל עד לאחרונה, מעט ידוע לגבי מבנה האוכלוסייה ואפיזואולוגיה של Y. תרמילי ברחבי העולם ובבתי גידול שונים (מינים מארחים, וכו '). מערכות הקלדה קיימות עבור מערכת ההקלדה של Y. תרמילים אינן עקביות, חוסר תאימות הדדית והצעת רזולוציה אפידמיולוגית נמוכה. כמה מחקרים מולקולריים על החיידק נערכו, העסקת טכניקות כגון רצף מקום הקלדה (mlst), פעמו-שדות ג'ל אלקטרופורזה (pfge) או כל הגנום רצף (wgs) ניתוח2,3,4 ,5. עם זאת, MLST אינו מספק ברזולוציה גבוהה מספיק עבור העקיבה שגרתית זיהום, בעוד PFGE היא עבודה תובענית ומייצרת תוצאות כי הם לא ניידים בקלות על פני מעבדות. בעוד ניתוח WGS יספק החלטה כמעט האולטימטיבי, הקמתה ויישום של ניתוחים כאלה היה לקדם את היכולות הטכניות-וביואינפורמטיקה כי עדיין להישאר מוגבלים למספר קטן יחסית של מעבדות.
לוקוס-מספר משתנה מספרים ניתוח חוזר (mlva) מייצג כלי מולקולרי הקלדה פשוטה ונגישה, אשר מציעה פתרון גנטי במקרים מסוימים כמעט התאמת את הניתוח של wgs6,7. הטכניקה מבוססת על וריאציה מספר חוזר בחזרה מספר משתנה שנבחרו (VNTR) המקום, וכתוצאה מכך נתוני פלט כי הוא מאוד התחבורה, ביצוע השוואה של מבודד פרופיל לכיוון מסדי נתונים מקוונים ומעבר מעבדות ישיר. למרות mlst נשאר תקן זהב עבור הקלדה אפידמיולוגיים של פתוגנים בקטריאליים רבים, מספר גדל והולך של מחקרים לזהות כוח מפלה גבוה יותר באופן משמעותי של mlst8,9,10. פרוטוקולים מספר פורסמו גם מיקוד דגים-פתוגניים חיידקים, כגון פרנסיזילה noatunensis, edwardsiella פיסקיקידה ו renibacterium salmoninarum11,12, . שלוש עשרה
הפרוטוקול MLVA 10-המקום הציג כאן, אשר לאחרונה יצרה את הבסיס עבור האוכלוסייה הנרחבת של מחקר של Y. תרמילי 14, כרוך הפקת דנ א ממושבות אגר מעובדות, PCR ו אלקטרופורזה קפילר (לסה נ), ואחריו במורד הזרם ביישומים סיליקו. עבור כל בודד נבדק, שני מולטיפלקס בדיקות, שניהם מכילים חמישה זוגות מתויג פלואורוסקופים (6FAM, נד או ויק) כל מיקוד באזור VNTR בודדים, מופעל במקביל בתנאים זהים. לאחר האימות של ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה (GE), מוצרי ה-PCR מדוללים לפני ניתוח CE, ופסגות המייצגות את המיפה המתאימים בגודלם מכונים בגודל של הקבצים שנוצרו באמצעות אלקטרופגרמה. יחד עם נוסחאות הספציפיות לוקוס חשבונאות עבור אי-התאמות משניים, ספציפיים לרצף בתבניות הנדידה של CE, שיחות VNTR CE מועסקים לאחר מכן לחישוב ספירות חוזרות של VNTR המשורשרים לפרופילי MLVA בעלי עשר ספרות. אלה משמשות כקלט עבור הערכות אפיזולוגיות (לדוגמה, לפי ניתוח אשכולות בדיאגרמות של עץ פורש מינימלי (MST)).
Protocol
התראה: בשלמותו של הפרוטוקול, מומלץ לבצע את כל הליכי מעבדה רטובים באמצעות מעילי מעבדה, כפפות חד פעמיות, ריאגנטים סטרילי וציוד. כמו כן, מומלץ להכין תגובות PCR בחדר נפרד (טרום PCR) לא משמש להגברה ו/או טיפול במוצרי PCR (פוסט-PCR). אחסן את כל הריאגנטים כפי שמומלץ על ידי היצרן. ראה טבלת חומרים לפרטים נוספים על ריאגנטים, ציוד ותוכנה בשימוש.
1. בקטריאלי לטיפוח והפקת דנ א גנומית
- לזרוע את החוצה בתרבויות טהורות על כל סוג אגר מתאים (המחברים השתמשו 5% בושם בדם אגר) ו דגירה ב 22 ° c עבור 1-2 ימים, או 15 ° צ' עבור 3-4 ימים.
- מכל צלחת אגר, לבחור מושבה ייצוגית אחת עם לולאה החיסון והעברה ל 1.5 mL צנטריפוגה צינורות המכילים 50 μL של מים באולטרמטוהרים. להשעות, ומערבולת בקצרה, ו דגירה עבור 7 דקות על בלוק חימום ב 100 ° c.
- צנטריפוגה ב 16 000 x g עבור 3 דקות ולהשתמש בפיפטה כדי להעביר בזהירות את supernatant לתוך שפופרת ריקה 1.5 mL. המשך לשלב הבא באמצעות הסופרנטאנט כ-DNA תבנית או חנות ב-20 ° c עד למועד זה.
2. התקנת מולטיפלקס ותנאי רכיבה על אופניים
הערה: כל מדדי היקף התגובה (2 לכל Y. תרמילי בידוד) צריך להכיל 12.5 μl של 2X מולטיפלקס PCR פלוס מיקס הורים, 0.1 כדי 0.2 μm של כל מתאים פריימר המתאים (טבלה 1) ו 3 μl של ה-DNA תבנית, מותאם נפח התגובה הסופי של 25 μl על ידי תוספת של מים בחינם RNase. המטרה לשמור על חשיפת אור של המסומנת מתויג קדימה-התחל לפחות (למשל, על ידי גלישת צינורות האחסון שלהם ברדיד אלומיניום).
- עבור כל אחד משני המגה-בתים של ה-PCR (שולחן 1), הכן תערובות מאסטר כמתואר לעיל (ללא DNA תבנית) על פי מספר הדגימות ועוד אחת חיובית ושליטה אחת שלילית. בנוסף, אפשר לנפח של 10% עודף. מערבולת המאסטר המוכן מתערבב בעדינות במהירות נמוכה.
- הפץ 22 μL של כל מיקס בנפרד לתוך בארות בודדות על רצועות ה-PCR או צלחות, בהתאם למספר הדגימות, ולהוסיף 3 μL של תבנית לכל באר (עבור פקדים חיוביים ושליליים, בהתאמה, להשתמש ב-DNA מתוך מאומת Y. תרמילי מים מסננים ומטוהרים. . תאטום וצנטריפוגה בקצרה
- הפעל את כל הדגימות על הציקליום התרמי של ה-PCR עם התוכנית הבאה: (i) 5 דקות ב 95 ° צ' (ii) 30 מחזורים של 0.5 דקות ב 95 ° צ', 1.5 דקות ב-60 ° c, ו 1 דקות ב-72 ° c ו-(iii) 60 דקות ב-68 ° c, ואחריו קירור עד 4 ° התוכנית תושלם בתוך פחות מ 3 שעות.
3. מבוא לאישור מטעם PCR
- על פי ההמלצות של היצרן, להכין נפח של 1.5% (w/v) agarose ג'ל ב-1x טריס-borate-EDTA (להיות) מאגר מתאים מספר תגובות ה-PCR להיבדק. לפני הליהוק, להוסיף 5 μL של לצבוע את גרעין של חומצה פלואורסצנטית לכל 50 μL של הפתרון ג'ל ומערבבים. השימוש מגשים מסרקים לפי הצורך ליהוק, השארת מספר מתאים של בארות חינם עבור מדרגות התייחסות DNA.
- לאחר ההגדרה, הטבול את ג'ל ב-1x TBE-חוצץ במערכת GE. מערבבים 5 μL של המוצר PCR יחד עם 2 μL של טעינת צבע והעברה ג'ל בארות. הוסף 5 μL של סולם DNA בבארות ריקות לעיון.
- הפעל את הג ב-110 V לכל 15 ס מ בערך 1 h והשתמש במערכת דימות/ויזוליזציה מבוססת-UV כדי לאמת את הנוכחות של מספר (עד חמש) להקות המייצגות את ה-PCR הגברה (ראה דוגמה באיור 1). . התעלם מהג המשך לשלב הבא או אחסן את מוצרי ה-PCR הנותרים ב-4 ° c עד לעיבוד נוסף.
4. התקנת אלקטרופורזה קפילר ותנאי הפעלה
- לאחר אישור של PCR הגברה, דלל את מוצרי PCR 1:10 (v/v) במים מטוהרים. . לאטום, לערבב ולצנטריפוגה בקצרה
- עבודה בחדר מיקס, להכין נפח של ערבוב הורים המורכב 9 μL של הטופסו 0.5 μL של תקן גודל לכל מוצר PCR (לאפשר 10% עודף נפח). מערבולת בקצרה ולהפיץ 9.5 μL לבארות על צלחת המתאימה למערכת CE הזמינים, לפני הוספת 0.5 μL של מוצר PCR מדולל. . לאטום, לערבב ולצנטריפוגה בקצרה
זהירות: . טפל בזהירות ערבוב של הפורמיד עם המים. יוצר חומצה פורמית, שהיא רעילה - באמצעות הציקליום התרמי של ה-PCR, השתמש בדגימות של 95 ° c עבור 3 דקות לפני הצינון עד 4 ° c ללא הגבלת זמן. צנטריפוגה לזמן קצר ולטעון את הצלחת אל מערכת CE מכויל על פי הוראות היצרן.
- הפעל ניתוח מקטעים CE באמצעות ריאגנטים המתאים למנגנון הבחירה ולהגדרות הבאות: 60 ° c; 5 s זריקות ב 1.6 kV (32 V לכל ס מ); 32 דקות ריצה זמן ב 15 kV (300 V לכל ס מ). CE ניתוח קטע של 24 בארות על 24-נימי (50 ס מ) בדרך כלל לוקח כ 50 דקות.
5. שיחות גודל VNTR, חישוב ספירה חוזרת ויצירת פרופיל MLVA
הערה: שלב 5.1 מתאר את מידת הקריאה של Y. תרמילי vntr מקבצי electropherogram באמצעות התוכנה הספציפית המופיעה ברשימת החומרים. עיין במדריך התוכנה לקבלת פרטים נוספים ופתרון בעיות. לשימוש בתוכנות אחרות, יש להתייעץ עם מדריכים מתאימים.
-
יבא קבצי תוצאת CE (שניים בכל לבודד). הגדר את שיטת הניתוח לברירת מחדל של Microsatellite ובחר את הבחירה המתאימה במוצר תחת גודל סטנדרטי, לפני לחיצה על לחצן נתח. בדוק את הזיהוי הנכון של קטעים סטנדרטיים בגודל באמצעות עורך התאמת גודל ותקן הקצאות שגויות בעליל.
- לאחר שבחרת את המדגם (ים) להיקרא, ללחוץ על לחצן הצג מגרשים ולהקיש Ctrl + A כדי לאפשר תצוגה של טבלת שינוי גודל. בעוד בלוח העליון, החזק את מקש Ctrl לאחר לחיצה על חמש הפסגות המייצגים את הגברה VNTR (השתמש בכלי התקרבות לפי הצורך).
הערה: עבור כל אחד ממוצרי ה-PCR, הelectropherogram יראה חמש פסגות מופץ בין שלושת הצבעים המועסקים (ראה 5 ' התוויות צבע של התחל קדימה בטבלה 1 ואת שתי הדוגמאות באיור 2). - הקש Ctrl + G כדי לסנן את טבלת שינוי הגודל, המציגה רק את המאפיינים של חמש הפסגות המסומנות, והקלט את הקריאות לגודל CE עבור כל מקור vntr (עם התייחסות לטבלה 1) עבור יישום במורד הזרם.
- לאחר שבחרת את המדגם (ים) להיקרא, ללחוץ על לחצן הצג מגרשים ולהקיש Ctrl + A כדי לאפשר תצוגה של טבלת שינוי גודל. בעוד בלוח העליון, החזק את מקש Ctrl לאחר לחיצה על חמש הפסגות המייצגים את הגברה VNTR (השתמש בכלי התקרבות לפי הצורך).
- על מנת להסביר את דפוסי הניידות במהלך לסה נ, יש לחשב ספירה חוזרת מדויקת של VNTR בהתאם לנוסחה המסופקת להלן, תוך שימוש בשיחות בגודל VNTR ביחד עם משתנים ספציפיים לוקוס (ראה טבלה 1). ליעילות, מומלץ להפוך תהליך זה לאוטומטי (לדוגמה, באמצעות תבנית גיליון אלקטרוני).
- שחזור VNTR מחושב עגול מונה את המספר השלם הקרוב ביותר ומשרשר למחרוזות בעלות עשר ספרות, כל אחד מהם מייצג את פרופיל ה-MLVA של תרמילי בודד מספר 1.
6. אשכול עץ מורחב מינימלי ניתוח של נתוני MLVA
הערה: שלב 6 מתאר את היצירה של דיאגרמות MST מנתוני Y. תרמילי mlva, באמצעות התוכנה הספציפית המופיעה ברשימת החומרים. עיין במדריך התוכנה לקבלת פרטים נוספים ופתרון בעיות. לשימוש בתוכנות אחרות, יש להתייעץ עם מדריכים מתאימים.
- צור מסד נתונים חדש ובוא לבחור להפעיל את תוסף MLVA.
- יבא מידע מסוג Y. תרמילי mlva ומטא-נתונים על-ידי בחירת נתונים של סוגי תווים ואחריהם ייבוא שדות ותווים (בחירה משנית נוספת בהתאם לתבנית האחסון). כשתתבקש, ציין כללי ייבוא בהתאם לתוכן קובץ הייבוא: בעמודה סוג יעד , סווג חזרה של vntr כערך תו: vntrוהמטא-נתונים השונים כפרטי הזנה: שדה מידע על ערכים .
הערה: עבור השוואה והקשר, ניתן גם לייבא את קבוצת הנתונים כולה שפורסמה (גישה פתוחה) יחד עם הנייר המקורי המעסיק את הפרוטוקול MLVA14. הפרופילים של MLVA והמטא-נתונים על האוסף המגוון של מבודד Y. תרמילי (n = 484) בתוך מחקר זה זמין מהחומר המשלים שלה (טבלאות S1 ו-S2) באמצעות הקישור הבא: https://aem.asm.org/content/84/16/e00730-18/figures-only#fig-data-additional-files - בחלונית ' סוג ניסוי ', פתחו את ערך vntr וקבעו ערכי מינימום ומקסימום לכל מקום vntr ל- 0 ו- 100, בהתאמה. תחת הגדרות כלליות, הגדר את מספר הספרות העשרוניות ל -0 ובחר מספרים תחת סוג נתונים. בדוק אם יש ערכים חסרים כאפס.
-
בחרו דוגמאות מיובאות שנועדו לניתוח אשכול MST ולחצו על הלחצן ' צור השוואה חדשה ' (בחלונית ' השוואה ').
- אם תרצה להציג את התצוגה החזותית של ה-MST, הקצה את הדגימות לקבוצות צבעוניות (לדוגמה, לפי תכונת מטה-נתונים מסוימת) על-ידי שימוש באפשרויות השונות הזמינות בחלונית ' קבוצות '.
הערה: ניתן גם ליצור/לשנות קבוצות באופן שונה, בהמשך לשלבים הבאים. - בחר ניתוח אשכולות מתקדם. .. ו- MST עבור נתוני הקטקטל כדי ליצור דיאגרמת MST המבוססת על הדוגמאות שנבחרו.
- שינוי נוסף של המצגת החזותית של MST כמועדפת (למשל, על ידי הוספת פרמטרים לחלוקה למחיצות, צומת/ענף תוויות, מרובי קישורים, אגדות, וכו '). ראה דוגמה באיור 3.
הערה: אשכול (מתחם שבטים) לחלוקה לסף של ≤ 4/10 לא זהה VNTR הבית, בנוסף להסתרת חיבורי הסניפים המייצגים > 5/10 לא זהה VNTR הבית, בעבר הועסק ניתוח אשכול MST מבוסס על מידע MLVA שנוצר באמצעות פרוטוקול זה14. בתנאי שערכת הנתונים הנ ל של 484 Y. תרמילי מילאן הייתה מיובאת, ניתן לכלול דוגמאות אלה גם עבור ניתוח אשכול MST (כפי שמתואר לעיל) כדי לספק הקשר גלובלי והיסטורי. זה יהיה למשל להקל על זיהוי של כל הדגימות המזוהה עם מתחמי שבטים שתוארו בעבר, כמו גם אלה המייצגים ליננים שאינם מתוארים עדיין. בהתאם למטא-נתונים הזמינים, ניתן לחשוף את דיאגרמת MST שתיווצר בדרכים שונות, לדוגמה, כדי לגלות את דפוסי הקיבוץ בסופו של דבר המקושרים לתכונות מסוימות (גיאוגרפיה, מחשב מארח, זמן וכו '). - במקרה הצורך, יצא את ה-MST הסופי בתבנית הרצויה באמצעות בחירת תמונת הייצוא .
- אם תרצה להציג את התצוגה החזותית של ה-MST, הקצה את הדגימות לקבוצות צבעוניות (לדוגמה, לפי תכונת מטה-נתונים מסוימת) על-ידי שימוש באפשרויות השונות הזמינות בחלונית ' קבוצות '.
Representative Results
בעקבות המגה-בית של ה-PCR כפי שמתואר כאן, תמונת GE טיפוסית מוודאת נוכחות של מספר רב של הגברה מכל תגובת ה-PCR מוצגת באיור 1. במורד הזרם CE ניתוח מקטע שבוצע על מוצרי ה-PCR מאומת, עבור כל אחד מתרמילי Y בודד נבדק, התוצאה היא שני הקבצים electropherogram המשמשים לקריאה בגודל של הרוח VNTR בהתאמה (איור 2). מניתוח של 484 Y. תרמילי מגוונות מבודד, אין חפיפה בטווח גודל אמפליקון היה נצפתה בין היכן vntr מתויג עם צבע זהה באותה המקבילה (שולחן 1)14. כל הפסגות אלקטרופלוטיות יכולות, לכן, להיות מזוהות בצבע בלתי משמעי.
לאחר ייבוא פרופילי MLVA ומטא-נתונים רלוונטיים לתוכנה המועדפת, ניתן לבנות דיאגרמות MST כמתואר לצורך בחינה מראש של דפוסי התעניינות אפידמיולוגיים בחומר. עיין במדריכים המתאימים לקבלת אפשרויות נוספות הזמינות בתוכנה המתאימה. לדוגמה, איור 3 מציג השוואה בין פרופילי mlva לבין מבודד ששוחזר מדגים הקשורים לחמש חוות סלמון שונות בנורווגיה.
המידות החוזרות והעקביות של עשרת הvivo של VNTR, כמו גם בתחומי החוץ והיציבות, מאומתים בעבר במחקר המקורי בהתבסס על פרוטוקול זה14. בקצרה, זה נעשה באמצעות רצף Sanger (גודל חוזר), ועל ידי הקלדת MLVA של מספר מבודדים בעקבות מעברים סדרתיים (בתחום החוץ) ומתוך התפרצויות מחלות בודדות (in vivo). יתר על כן, את היציבות הסביבתית של המקום לאורך זמן נבדק על ידי הקלדת מספר ' מאמץ הבית ' מבודד התאושש במשך מספר שנים מאתרי ייצור מתוקים נגוע בהתמדה עבור סלמון אטלנטי.
איור 1 : אלקטרופורזה ג'ל מוודאת נוכחות של מוצרים PCR מרובים. התמונה מאשרת נוכחות של מספר רב של מגביר PCR בכל 12 הנתיבים המכילים דגימות, עם הנתיב הראשון המייצג את סולם ה-DNA המשמש. הגדלים של שברי הסולם הנבחרים הצביעו, כאשר יש את שיטת ה-PCR והמתח (ראה טבלה S1 בגוללה ואח ' 201814) השתייכות לכל נתיב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : Electropherograms מראה פסגות המתאימות הגברה VNTR. שמות של היכן VNTR שונים מסומנים, עם תוויות צבען (ויק = ירוק; נד = שחור; 6FAM = כחול) בסוגריים. שני electropherograms (ה-PCR שיטת הראשון; שיטת ה-PCR 2 למטה) מקורם בהקלדת בידוד של Y יחיד. פסגות תפוזים (לצבוע ליז) מייצגים את תקן גודל מועסק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : לדוגמה עץ פורש מינימלי עבור הערכה אפידמיוולוגית. הדיאגרמה מבוססת על פרופילי MLVA מ -Y. תרמילי מבודד התאושש מסלמון אטלנטי ב חמש חוות נורווגית שונים (1-5; ראה האגדה) חווה התפרצויות yerisniosis חוזרות ונשנות. ניתן להבחין בנטייה לקיבוץ ברור המקושרת למקור החווה. מרובי קישורים הצג את כל החיבורים האפשריים הכרוכים ב≤ 1/10 לא זהים (ראה מקרא). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : Electropherogram המחשה מגמגם ומפוצל פסגות. במקרה זה, שניהם מתרחשים בו זמנית, וזה לא תמיד המקרה. השיא הארוך והגבוה יותר, המייצג את לוקוס VNTR YR1070, ניתן להבחין בקלות. הצג מוגדל ומציג רק פסגות צבע כחול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: מאפייני מקום VNTR. מאפיינים רלוונטיים של האזורים הנוכחיים של מערך הפרוטוקולים של מדינת מילאן.
Discussion
שני המגה בדיקות הציג כאן הופיעו חזק יחסית בפני איכות ה-DNA של תבנית ירודה, אבל היעדר הגברה PCR היה בכל זאת לעתים בעת שימוש בתבניות עם ריכוזי DNA גבוהה מאוד. סוגיות אלה נפתרו בקלות על ידי דילול התבניות לפני ה-PCR. שיטות אחרות עבור חילוץ DNA מאשר אחד המועסקים כאן עשוי לשמש גם (למשל, ערכות מסחריות).
למרות שחמש הגברה צפויות בכל הנוגע לתגובת ה-PCR, חמש הלהקות הבולטות באופן חזותי לא תמיד צפויות מ-GE, כמו כמה (מתויג שונה) VNTR הרוח בתוך התגובה אותה יש טווחי גודל חופפים. זמן הארכת ה-PCR הסופי של 60 דקות עשוי להיות מקוצר במידת הצורך, אך סביר להניח שיגרום להתרחשות מוגברת של פסגות מפוצלות ב-CE electropherograms העוקבות (ראה להלן). בעיקר, כמטרה של צעד ג ' נרל אלקטריק הוא גרידא עבור אימות איכותי של PCR הגברה, זמן ריצה, מתח ו/או ג'ל מתכון ניתן להתאים כמועדפת. אם להקות חלשות במיוחד נצפו על ידי GE, ייתכן שיהיה מומלץ להקטין את מקדם הדילול של דגימות אלה לפני לסה נ.
בעוד פרוטוקול CE המתואר כאן הופעל על מכשיר מסחרי מסוים אלקטרופורזה נימי (ראה טבלת חומרים), מערכות CE שונות עשויות להיות דרישות דוגמה שונות, אשר עשוי בתורו להנחות כמה שינויים בפרוטוקול . עיין במדריך המתאים ליצרן מערכת CE לקבלת הוראות על ריאגנטים/ציוד מתאים, כיול וכו ' עבור ניתוח קטע. קיימת גם אפשרות שהאמפליטים המווטים בדפוסי הניידות שנצפו במהלך CE עשויים להיות שונים, יחסית, ממערכות CE ו/או מכונות, כפי שתועד בעבר בפרוטוקולים של mlva15,16. אם הדבר מתרחש במידה שבה מושפעים ספירות החזרה של VNTR סופי (מעוגל), המשמעות היא שהמשתנים והערכים הספציפיים למיקום (טבלה 1), המשמשים לקביעת ספירות חוזרות של vntr, יש לכייל מחדש. זה כולל רגרסיה לינארית על מגרשים השוואת מידות רצף מדויק לעומת שיחות CE גודל, כפי שמתואר על ידי Gulla et al. 201814.
לפצל פסגות ופסגות מגמגם, גם פריטים ידועים ב CE מבוסס מmlva17, ניתן לצפות ב electropherograms במהלך הקריאה בגודל (איור 4). בעוד הפסגות מגמגם צריך להתעלם, השיא ארוך יותר צריך להיבחר בעקביות עבור יישומי מטה במקרה של פסגות מפוצל מופרדים על ידי זוג בסיס יחיד. יתרה מזאת, פסגות חסרות המציינות כי העדר מסוים של VNTR הוא נדיר, אך עלול להתרחש, ובמקרה כזה יש להקצות ספירה חוזרת של ' 0 '. אם התרבות ההתחלתית ממנו מופק ה-DNA אינו טהור (כלומר, מכיל יותר מסוג Y. תרמילי משנה), פסגות גבוהות מרובות המתאימות לאלולים שונים של אותו מקום/המקום יכול להיות נצפתה בעקבות CE. הזנים המשניים חייבים להתבצע ממושבות בודדות לפני הפקת ה-DNA החדשה להקלדה מחדש.
כאמור בפרוטוקול, ה-DNA תבנית עבור PCR צריך כברירת מחדל להיות מופק מתרבויות טהור של Y. תרמילי. במקרים מסוימים, עם זאת, דגימות ביצים נוזלי בדיקות חיוביות של Y. תרמילי ידי qpcr (Ct-ערכים < 27) היו בהצלחה mlva הוקלד ישירות, ללא culturing מראש, באמצעות כמות מוגברת של דנ א גנומית (מופק עם ערכת מסחרית) כתבנית. למרות שגישה זו לא נבדקה באופן מקיף ולא אומתה, היא מצביעה על הפוטנציאל של שיטת MLVA זו לבדיקת מטריצות ביולוגיות מורכבות המכילות דנ א ממגוון של אורגניזמים שונים בנוסף ל -Y. תרמילי.
הליך ההקלדה MLVA כולו הציג כאן, מ-DNA הפקת הערכה אפיזואוולוגית, ניתן להשלים יום עבודה אחד. עם זאת, מספר הדגימות הנבדקות נמצא בקשר תת-לינארי עם הזמן הנדרש להפקת DNA, PCR ו-CE, ולכן השיטה היא הרבה יותר יעילה בזמן הפעלת דגימות מרובות בו זמנית. זה אף על פי כן המקרה עבור רוב השיטות המבוססות על מעבדה, וככלי עבור הקלדה אפידמיוולוגית של Y. תרמילי, השילוב של ברזולוציה גבוהה, פשטות וניידות עושה את הדבר הזה mlva מעולה לפרוטוקולים שפורסמו בעבר4 ,5. הוא גם שימש כדי לאמת את הרלוונטיות המוגבלת אפידמיולוגיים של Y. תרמילי הקלדה14.
באמצעות מחקר מקיף מבוסס MLVA האוכלוסייה מעורבים 484 Y. תרמילי מבודד התאושש מתוך מגוון רחב של מקורות ובתי גידול (מארח דגים, סביבה, וכו '), ההבנה שלנו לגבי אפיזואוטיפולוגיה ואוכלוסיה בנה של פתוגן זה דג חשוב הוגדלה באופן משמעותי14. MLVA הקלדה אפשרה מעקב של שיבוטים הפיץ אנתרופוגנתית מעל עשורים, ככל הנראה באמצעות הובלה של דגים, כמו גם זיהוי של זנים סגורים מקומית. יתר על כן, בעוד כמה מתחמי שבטיים של החיידק יכול בבירור להיות מזוהה עם מחלה מארחים דגים מסוימים (הקשת פורל וסלמון אטלנטי, בהתאמה), אחרים רק התאושש ממקורות סביבתיים ו/או דגים מושפעים קלינית דגימות. תחולתה של השיטה אינה מוגבלת רק למעקב אחר זיהום, שכן היא עשויה גם לספק מידע לגבי הרלוונטיות הפוטנציאלית לפיתוח חיסונים, הערכת סיכונים ואחזקה של הביולוגיה הלאומית. הוא נמצא כרגע בשימוש פעיל במכון הווטרינרי הנורבגי ככלי לחקירת האבחונים של Y. תרמילי בחקלאות ימית.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחקר הנוכחי מומן על ידי קרן המחקר הנורבגי מאכלי ים, FHF (פרויקט nos. 901119 ו 901505). אנו רוצים להודות לכל התורמים של מבודד חיידקי ודגימות המשמשות במהלך פיתוח השיטה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22°C/15°C incubator | As preferred. | NA | |
| 5' Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | 450007 | Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| Agarose, universal, peqGOLD | VWR | 732-2789P/732-2788 | Used during gel electrophoresis. |
| Avant 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | A30469 | Used for capillary electrophoresis fragment analysis. |
| BioNumerics7 modules | Applied Maths | NA | Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data. |
| Centrifuge(s) | As preferred. | NA | |
| Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | A15612 | Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Loading dye used during gel electrophoresis. |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Centrifuge tubes used during DNA extraction. |
| Freezer | As preferred. | NA | |
| Fume cupboard | As preferred. | NA | |
| Gel electrophoresis system | As preferred. | NA | |
| GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water | Biotium | 41003 | Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis. |
| GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis. |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Fisher Scientific | SM0373 | DNA ladder used during gel electrophoresis. |
| GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | Size standard used during capillary electrophoresis. |
| Heating block | As preferred. | NA | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320/4440753 | Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts. |
| Milli-Q water | NA | NA | Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house. |
| Multiplex PCR Plus Kit | Qiagen | 206151/206152 | |
| PCR thermal cycler | As preferred. | NA | |
| POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers | Thermo Fisher Scientific | A26077/4393713/4393709 | Separation matrix used during capillary electrophoresis. |
| Pure culture Yersinia ruckeri | NA | NA | E.g. cryopreserved or fresh. |
| RNase-free water | Qiagen | NA | In: Multiplex PCR Plus Kit |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| Trypsine soy agar/bovine blood agar | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| UV-based gel imaging/visualisation system | As preferred. | NA | |
| Vortexer | As preferred. | NA |
References
- Barnes, A. C. Enteric redmouth disease (ERM) (Yersinia ruckeri). Fish Diseases and Disorders, Vol 3: Viral, Bacterial and Fungal Infections. 3, 484-511 (2011).
- Barnes, A. C., et al. Whole genome analysis of Yersinia ruckeri isolated over 27 years in Australia and New Zealand reveals geographical endemism over multiple lineages and recent evolution under host selection. Microbial Genomics. 2 (11), 000095 (2016).
- Calvez, S., Mangion, C., Douet, D. G., Daniel, P. Pulsed-field gel electrophoresis and multi locus sequence typing for characterizing genotype variability of Yersinia ruckeri isolated from farmed fish in France. Veterinary Research. 46, 73 (2015).
- Bastardo, A., Ravelo, C., Romalde, J. L. Multilocus sequence typing reveals high genetic diversity and epidemic population structure for the fish pathogen Yersinia ruckeri. Environmental Microbiology. 14 (8), 1888-1897 (2012).
- Wheeler, R. W., et al. Yersinia ruckeri biotype 2 isolates from mainland Europe and the UK likely represent different clonal groups. Diseases of Aquatic Organisms. 84 (1), 25-33 (2009).
- Eyre, D. W., et al. Comparison of multilocus variable-number tandem-repeat analysis and whole-genome sequencing for investigation of Clostridium difficile transmission. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4141-4149 (2013).
- Sun, M., et al. Multiple Locus Variable-Number Tandem-Repeat and Single-Nucleotide Polymorphism-Based Brucella Typing Reveals Multiple Lineages in Brucella melitensis Currently Endemic in China. Frontiers in Veterinary Science. 4, (2017).
- Bouchouicha, R., et al. Comparison of the performances of MLVA vs. the main other typing techniques for Bartonella henselae. Clinical Microbiology and Infection. 15, SUPPL 2 104-105 (2009).
- Dahyot, S., et al. Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) and Tandem Repeat Sequence Typing (TRST), helpful tools for subtyping Staphylococcus lugdunensis. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
- Elberse, K. E. M., Nunes, S., Sá-Leão, R., van der Heide, H. G. J., Schouls, L. M. Multiple-locus variable number tandem repeat analysis for Streptococcus pneumoniae: Comparison with PFGE and MLST. PLoS ONE. 6 (5), (2011).
- Matejusova, I., et al. Multilocus variable-number tandem-repeat genotyping of Renibacterium salmoninarum, a bacterium causing bacterial kidney disease in salmonid fish. BMC microbiology. 13, 285 (2013).
- Duodu, S., et al. An improved multiple-locus variable-number of tandem repeat analysis (MLVA) for the fish pathogen Francisella noatunensis using capillary electrophoresis. BMC Veterinary Research. 9, 252 (2013).
- Abayneh, T., Colquhoun, D. J., Austin, D., Sørum, H. Multilocus variable number tandem repeat analysis of Edwardsiella piscicida isolates pathogenic to fish. Journal of Fish Diseases. 37 (11), 941-948 (2014).
- Gulla, S., et al. Multilocus variable-number tandem-repeat analysis of Yersinia ruckeri confirms the existence of host specificity, geographic endemism, and anthropogenic dissemination of virulent clones. Applied and Environmental Microbiology. 84 (16), (2018).
- Pasqualotto, A. C., Denning, D. W., Anderson, M. J. A cautionary tale: Lack of consistency in allele sizes between two laboratories for a published multilocus microsatellite typing system. Journal of Clinical Microbiology. 45 (2), 522-528 (2007).
- Lista, F., et al. Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis. BMC Microbiology. 6, 33 (2006).
- Thermo Fisher Scientific DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf (2014).
