Analisi di miRNA combinatoria trattamenti per regolare il ciclo cellulare e l'angiogenesi
Summary
terapeutica di miRNA hanno un potenziale significativo nella regolazione della progressione del cancro. Ha dimostrato qui approcci analitici utilizzati per l’identificazione dell’attività di un trattamento di combinatoria miRNA nell’arrestare il ciclo cellulare e l’angiogenesi.
Abstract
Il cancro del polmone (LC) è la causa principale delle morti legate al cancro in tutto il mondo. Simile ad altre cellule di cancro, una caratteristica fondamentale delle cellule LC è proliferazione non regolamentata e la divisione cellulare. Inibizione della proliferazione di arrestare la progressione del ciclo cellulare ha dimostrato di essere un promettente approccio per il trattamento del cancro, tra cui LC.
terapeutica di miRNA sono emerse come regolatori di genico post-trascrizionale importante e sempre più stanno studiandi per uso nel trattamento del cancro. In recenti lavori, abbiamo utilizzato due Mirna, miR-143 e miR-506, per regolare la progressione del ciclo cellulare. Transfected le cellule A549 non a piccole cellule del polmone cancro (NSCLC), modificazioni dell’espressione genica sono stati analizzati e attività apoptotica dovuta al trattamento infine è stato analizzato. Downregulation di chinasi ciclina-dipendenti (CDKs) sono stati rilevati (cioè, CDK1, CDK4 e CDK6), e ciclo cellulare fermato presso le transizioni di fase di G1/S e G2/M. Analisi del percorso indicano potenziali attività antiangiogenica del trattamento, che conferisce l’approccio multiforme attività. Qui, le metodologie utilizzate per identificare l’attività di miRNA per quanto riguarda l’inibizione del ciclo cellulare, induzione di apoptosi e gli effetti del trattamento sulle cellule endoteliali tramite inibizione dell’angiogenesi sono descritti. Si spera che i metodi presentati qui sosterrà la ricerca futura su miRNA terapeutica e attività corrispondente e che i dati rappresentativi guiderà altri ricercatori durante analisi sperimentali.
Introduction
Il ciclo cellulare è una combinazione di più eventi normativi che consentono la duplicazione del DNA e la proliferazione cellulare attraverso il processo mitotico1. Chinasi ciclina-dipendenti (CDKs) regolare e promuovere il ciclo cellulare2. Tra questi, il CDK mitotica (CDK1) e interfase CDKs (CDK2, CDK4 e CDK6) hanno un ruolo fondamentale nel ciclo cellulare progressione3. Proteina del retinoblastoma (Rb) è fosforilata da CDK4/CDK6 complessi per consentire il ciclo cellulare progressione4, e l’attivazione CDK1 è essenziale per la divisione cellulare successo5. Numerosi inibitori delle CDK sono stati sviluppati e valutati in studi clinici negli ultimi decenni, che indica il potenziale di targeting CDKs nel trattamento del cancro. Infatti, tre inibitori delle CDK sono stati approvati per il trattamento di cancro al seno recentemente6,7,8,9,10. Così, CDKs, e in particolare, CDK1 e CDK4/6, sono di grande interesse nella regolazione della progressione del cancro delle cellule.
Mirna (miRs) sono piccole, non-codificazione RNAs e regolatori post-trascrizionale dell’espressione genica, circa il 30% di tutti i geni umani11di regolazione. Loro attività è basata sulla repressione traduzionale o degradazione del RNA messaggero (mRNA)12. Indicativo del loro significato biologico, sono stati identificati più di 5.000 Mirna e una molecola di miRNA singolo può regolare più geni11,13. Ancora più importante, espressione dei miRNA è stata associata con diverse malattie e Stati di malattia, compreso cancro13. Infatti, i miRNA sono stati caratterizzati come oncogeni o soppressori tumorali, essendo in grado di promuovere o sopprimere tumore sviluppo e progressione di14,15. L’espressione relativa di Mirna in tessuti malati può regolare la progressione di malattia; così, consegna esogeno di Mirna ha potenziale terapeutico.
Cancro del polmone è la principale causa di decessi per cancro e più grande di 60% di tutti i tumori maligni del polmone non a piccole cellule16,i cancri del polmone17, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni inferiore al 20%18. L’uso di miR-143-3 p e miR-506-3 p recentemente è stata valutata per il targeting i cicli delle cellule nel polmone cancro cellule11. miR-143 e miR-506 hanno sequenze di complementarità CDK1 e CDK4/CDK6, e sono stati analizzati gli effetti di questi due miRs sulle cellule A549. I dati sperimentali sono presentati e discussi in questa carta. Espressione genica, progressione del ciclo cellulare e apoptosi sono stati valutati usando diversi disegni sperimentali e punti temporali dopo trasfezione. Abbiamo usato metodi quantitativi in tempo reale di PCR (RT-qPCR) insieme con l’analisi di microarray per misurare l’espressione di specifici geni, e sequenziamento di RNA di nuova generazione è stato usato per determinare di disregolazione genica globale11. Quest’ultimo metodo identifica l’abbondanza relativa di trascrizione di ogni gene con alta sensibilità e riproducibilità, mentre migliaia di geni possa essere analizzati da una singola analisi sperimentale. Inoltre, analisi apoptotiche dovuto il trattamento di miRNA è stata eseguita e viene descritto qui. Bioinformatica ha completato l’analisi dei percorsi. Presentato qui sono protocolli utilizzati per l’analisi di terapeutico potenziale della combinatoria miR-143 e miR-506.
Lo scopo principale di questo protocollo è quello di identificare gli effetti dei miRNA nelle cellule, con un focus sul ciclo cellulare. La varietà delle tecniche qui presentate spaziano dalla analisi di espressione genica romanzo e pretraduzione (utilizzando qPCR) di elaborare tecniche per l’analisi del gene a livello proteico, come ad esempio l’analisi di microarray. Si spera che questo rapporto è utile per i ricercatori interessati a lavorare con Mirna. Inoltre, la metodologia per l’analisi cytometric di flusso del ciclo cellulare e apoptosi delle cellule è presentato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mirna possono operare come terapie mirate per il trattamento del cancro, riconoscendo l’alterazione dei livelli di espressione in malati vs tessuti normali. Questo studio mira a determinare i miRNA che potenzialmente fermare la progressione del ciclo cellulare durante le fasi multiple. È stato identificato che miR-143 e miR-506 arrestare il ciclo cellulare delle cellule tumorali e i protocolli presentati volti a comprendere l’attività di questo trattamento di miRNA combinatoria.
Le metodolog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Non vengono dichiarati conflitti di interesse.
Materials
| -80 °C Freezer | VWR | VWR40086A | |
| 96 well plate | CELLTREAT Scientific | 50-607-511 | |
| 96-well Microwell Plates | Thermo Scientific | 12-556-008 | |
| A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Agarose | VWR | 0710-25G | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938c | |
| Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA | Ambion | AM4611 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions | Full Moon Bio | KAS02 | |
| Bright field microscope | Microscoptics | IV-900 | |
| Bright field microscope | New Star Environment LLC | ||
| Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides | Full Moon Bio | ACC058 | |
| Cell Logic+ Biosafety Cabinate | Labconco | 342391100 | |
| Cellquest Pro | BD bioscience | Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle phase and for calculating the population distribution for the analysis of apoptosis | |
| CFX96 Real Time System | BioRad | CFX96 Optics Module | |
| Chemidoc Touch Imaging System | BioRad | Chemidoc Touch Imaging System | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | HERAcell 150i | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Trevigen | 3433-010-01 | |
| Digital Camera | AmScope | FMA050 | |
| DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine | VWR | VWRL0100-0500 | |
| DNAse I | Zymo Research | E1010 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Biosciences | 356006 | |
| Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets | Eppendrof | 05-403-152 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, | Fisher BioReagents | BP2818500 | |
| Ethidium bromide | Alfa acar | L07462 | |
| F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning | Corning | 45000-354 | |
| FACS Calibur Flowcytometer | Becton Dickinson | ||
| Fetal Bovine Serum – Premium | Antlanta Biologicals | S11150 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 10438026 | |
| Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps | Fisherbrand Basix | 02-682-002 | |
| Forma Series II water Jacket CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Heparin Solution (5000 U/mL) | Hospira | NDC#63739-920-11 | |
| Horixontal Electrophoresis system | Benchtop lab system | BT102 | |
| hsa-miR-143-3p miRNA Mimic | ABM | MCH01315 | |
| hsa-miR-506-3p miRNA Mimic | ABM | MCH02824 | |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) | Thermo Scientific | PHC9394 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Individual donors | IRB# A15-3891 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | SH30256FS | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | Results: Used for bioinformatics pathway analysis | |
| Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10-977-015 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11-668-027 | |
| Loading dye 10X | ward's science+ | 470024-814 | |
| Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) | Sigma Aldrich | M4530 | |
| Microscope Digital Camera | AmScope | MU130 | |
| Modfit LT | Verity Software | Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | NanoDrop one C | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 31985-070 | |
| Penicillin-streptomycin 10/10 | Antlanta Biologicals | B21210 | |
| Power UP sybr green master mix | Applied Biosystems | A25780 | |
| Propidium Iodide | MP Biochemicals LLC | IC19545825 | |
| Proscanarray HT Microarray scanner | Perkin elmer | ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm. | |
| q PCR optical adhesive cover | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Quick-RNA Kits | Zymo Research | R1055 | |
| Ribonuclease A from Bovine pancreas | Sigma | R6513-50MG | |
| ScanArray Express | PerkinElmer | Step 7.33: Microarray analysis software | |
| Shaker | Thermo Scientific | 2314 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | ||
| SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml | VWR | 470224-998 | |
| SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml | VWR | 470225-004 | |
| TBS Buffer, 20x liquid | VWR | 10791-796 | |
| Temperature controlled centrifuge matchine | Thermo Scientific | ST16R | |
| Temperature controlled micro centrifuge matchine | Eppendrof | 5415R | |
| Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 12-556-009 | |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Thermo Scientific | PI23225 | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Thermo Scientific | PI89900 | |
| Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates | Thermo Scientific | AB0800WL | |
| Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) | Thermo Scientific | AB1453B | |
| Ultra Low Range DNA Ladder | Invitrogen | 10597012 | |
| VWR standard solid door laboratory refrigerator | VWR |
References
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